Trên cơ sở nghiên cứu tối −u hoá một số yếu tố chính ảnh h−ởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non dòng ngô HR8, chúng tôi đã xây dựng và hoàn thiện quy trình tái sinh nh− sau:
Thu mẫu và tách phôi
Các dòng ngô cho mẫu bắp làm thí nghiệm đ−ợc bao cách ly ngay từ khi xuất hiện cờ và bắp. Bắp đ−ợc thụ phấn bằng tay. Bắp non sau khi thụ phấn khoảng 18-
Hình 6. ảnh h−ởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo của phôi non dòng ngô HR8
0,5
2,0 4,0
20 ngày đ−ợc thu để tách phôi. Mẫu bắp non có thể đ−ợc l−u giữ ở 40C thời gian từ 2-4 ngày.
Khử trùng bề mặt ngoài của bắp bằng ethanol 700, bóc bỏ các lá bao ngoài và tách phôi trong điều kiện vô trùng.
Tạo mô sẹo
Phôi non đ−ợc cấy trên môi tr−ờng tạo mô sẹo CN6 với phần tế bào scutellum h−ớng lên trên, phần trụ phôi tiếp xúc với bề mặt môi tr−ờng (Green and Phillips, 1975).
Các phôi có kích th−ớc từ 1-2mm đ−ợc chọn để nuôi cấy và tái sinh cây. Kích th−ớc và chất l−ợng của phôi nuôi cấy ảnh h−ởng rất nhiều đến hiệu quả tái sinh cây, vì thế các phôi có kích th−ớc quá nhỏ, mềm và trong nên đ−ợc loại bỏ trong quá trình tách.
Mật độ cấy 15 phôi/đĩa Petri chứa 8mml môi tr−ờng.
Phôi non cấy trên môi tr−ờng CN6 đ−ợc nuôi trong điều kiện tối, ở 250C, thời gian từ 2-3 tuần để tạo mô sẹo.
Tạo mô sẹo phôi hoá
Mô sẹo tạo thành đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng ECM, nuôi trong điều kiện tối, ở 250C, thời gian từ 1-2 tuần để tạo mô sẹo phôi hoá.
Mô sẹo phôi hoá ở ngô th−ờng có 2 dạng chính đ−ợc phân biệt dựa trên sự khác nhau về hình thái (Armstrong & Green, 1985):
- Mô sẹo dạng I: Là mô sẹo có dạng cứng, chắc từ đó hình thành các mô sẹo phôi hoá đã biệt hoá về mặt hình thái.
- Mô sẹo dạng II: là mô sẹo có dạng xốp, dễ vỡ vụn, từ đó hình thành nên nhiều các phôi soma tách rời trên bề mặt mẫu nuôi cấy.
Có thể quan sát d−ới kính hiển vi để phân biệt giữa mô sẹo dạng I và dạng II.
Hầu hết mô sẹo tạo thành từ phôi non dòng HR8 là mô sẹo dạng II. ở các dòng ngô lai, mô sẹo tạo thành chủ yếu là mô sẹo dạng I.
Mô sẹo phôi hoá đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng SM, nuôi trong điều kiện sáng, thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày, c−ờng độ chiếu sáng 1200-1600 lux ở 250C, thời gian từ 1-2 tuần để tái sinh chồi.
Ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh
Chồi tái sinh đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng RM để tạo rễ và cây hoàn chỉnh. Cây con tái sinh có 2-3 lá và 3-4 rễ nhận đ−ợc sau 7-10 ngày nuôi cấy. Sau đó, cây tái sinh đ−ợc chuyển ra đất trồng.