Xây dựng một hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây hoàn chỉnh là tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu biến nạp gen. Sau đây là những hệ thống nuôi cấy th−ờng đ−ợc sử dụng:
• Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc di truyền thấp, ch−a phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền cao. Mô sẹo thu đ−ợc bằng nuôi cấy in vitro các cơ quan của thực vật nh− thân, rễ, lá, hoa... trong môi tr−ờng chứa chất điều hoà sinh tr−ởng nhóm auxin với điều kiện nuôi cấy thích hợp. Mô sẹo có thể đ−ợc duy trì liên tục trên môi tr−ờng nuôi cấy bằng cách cấy chuyển định kì (Lê Trần Bình & CS, 1997 [1]).
3.2. Xây dựng Hệ thống tái sinh
3.2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non
3.2.1.1. Cơ sở khoa học và các nghiên cứu về hệ thống tái sinh in vitro 3.2.1.2. Vật liệu và ph−ơng pháp
3.2.1.3. Hoàn thiện hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây từ phôi non 3.2.1.4. Quy trình tái sinh cây từ phôi non
3.2.1.5. Đánh giá khả năng tái sinh của một số dòng ngô Việt Nam
3.2.2. Xây dựng hệ thống tái sinh phôi từ nuôi cấy bao phấn
3.2.2.1. Đặt vấn đề
3.2.2.2. Vật liệu và ph−ơng pháp.
3.2.2.3. Phản ứng của các giống ngô Việt Nam trong nuôi cấy bao phấn 3.2.2.4. Tối −u hoá quy trình tái sinh phôi từ nuôi cấy bao phấn
3.2.2.5. Quy trình tái sinh cây từ bao phấn
3.2.3. Tạo các dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao bằng ph−ơng pháp di truyền
3.2.3.1. Vật liệu và ph−ơng pháp.
3.2.3.2. Kết quả chọn tạo các dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao 3.1.4. Kết luận
• Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù là kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn hoặc cụm nhỏ tế bào trong môi tr−ờng lỏng. Các tế bào này cũng đ−ợc tạo từ mô sẹo có nguồn gốc từ thân, rễ, lá, hoa, phôi... Tuy nhiên nh−ợc điểm của ph−ơng pháp này là thời gian nuôi cấy dài và ảnh h−ởng trực tiếp tới khả năng tái sinh cây (Dix, 1986 [44]).
• Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc chỉ còn lại khối nguyên sinh chất đ−ợc bao bọc bởi màng nguyên sinh khi đ−ợc nuôi cấy trên môi tr−ờng thích hợp thì tái tạo thành tế bào, phát triển thành khối mô sẹo và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. ứng dụng có ý nghĩa nhất của ph−ơng pháp này là tạo cây soma, tạo cây lai tế bào chất thông qua dung hợp tế bào trần và biến nạp gen.
Nhằm mục đích xây dựng một hệ thống nuôi cấy tái sinh cây phục vụ chuyển gen chúng ta cần nghiên cứu đến khả năng sống sót của tế bào sau khi chuyển gen trên môi tr−ờng chọn lọc. Do vậy hệ thống nuôi cấy huyền phù th−ờng hiếm khi đ−ợc sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen, đặc biệt chuyển gen nhờ vi khuẩn
Agrobacterium. Trong khi đó, hệ thống nuôi cấy qua mô sẹo lại rất thích hợp với một số −u điểm nh− có tỉ lệ tái sinh cây cao, thời gian nuôi cấy không quá dài, thao tác nuôi cấy đơn giản. Tái sinh cây qua con đ−ờng mô sẹo có thể hình thành phôi hay tái sinh tạo chồi trực tiếp. Tuy nhiên, cây tái sinh từ phôi soma xuất phát từ một tế bào đơn, riêng lẻ và phát triển thành một cây hoàn chỉnh nên duy trì đ−ợc tính đồng nhất của hệ gen và do vậy hạn chế hiện t−ợng khảm ở cây chuyển gen (Lê Trần Bình & CS, 1997 [1]).
Lần đầu tiên cây ngô in vitro đã đ−ợc Green và Philips (1975) [58] tái sinh từ các mẫu phôi non. Tiếp theo đó có nhiều nghiên cứu thành công về tái sinh cây ngô từ các nguồn vật liệu khác nhau nh− bao phấn (Ting & CS, 1981) [104], phôi non (Lu & CS, 1982; Lu và Vasil, 1983; Vasil & CS, 1984) [75] [74] [112], tế bào mày ngô (Suprasanna & CS, 1986) [102], hoa non (Pareddy và Petolino, 1990) [82], cờ non (Rhodes & CS, 1986; Songstad & CS, 1992) [87], [99], mẩu lá (Conger & CS, 1987; Ray và Gosh, 1990) [41], [86], đoạn thân cây con (Santos & CS, 1984) [94],
chồi đỉnh (O’Connor-Sánchez & CS, 2002; Zhong & CS, 1992) [80], [120] và mô phân sinh chồi đỉnh (Sairam & CS, 2003; Zhang & CS, 2002) [90], [119].
Nhìn chung, hệ thống tái sinh cây đạt hiệu quả cao hơn cả là tái sinh thông qua mô sẹo tạo thành từ phôi non. Phôi non đ−ợc sử dụng làm nguồn vật liệu chính trong các nghiên cứu nuôi cấy mô ở ngô (Lu & CS, 1982; Lu và Vasil, 1983; Vasil & CS, 1984) [75], [74], [112], nh−ng việc thu nhận th−ờng xuyên vật liệu phôi non gặp nhiều khó khăn và việc có đ−ợc phôi non ở giai đoạn thích hợp cho nuôi cấy cũng bị hạn chế (Huang & Wei, 2004) [66]. Để có đ−ợc hiệu quả tái sinh cao thì cần phải nghiên cứu sự phát sinh hình thái của phôi non trong điều kiện in vitro và các yếu tố ảnh h−ởng đến sự phát triển của phôi.
Sự phát triển của phôi ngô non trong điều kiện in vitro
Matthys-Rochon & CS (1998) [77] khi nghiên cứu sự phát triển in vitro của phôi ngô non từ các tế bào tiền phôi cho thấy thời gian để các tế bào này phát triển thành phôi ở giai đoạn 1-2 dài hơn so với ở cây từ 1-2 ngày và cần khoảng 2 tháng để phát triển thành cây tr−ởng thành. Và cũng cần l−u ý rằng mùa vụ cũng ảnh h−ởng đến sự phát triển của các tế bào tiền phôi. Từ tháng 5 đến tháng 9, khả năng phát triển của chúng đã tăng một cách đáng kể. Loại đ−ờng sử dụng trong môi tr−ờng nuôi cấy cũng có ảnh h−ởng đến sự phát triển của phôi. Đ−ờng sucrose sẽ đ−ợc biến đổi thành glucose và fructose. Fructose đ−ợc xem nh− là một nguồn cacbon không có hiệu quả (Vasil, 1984) [112] do vậy có thể các tế bào phôi hoá sẽ sử dụng glucose tr−ớc sau đó mới sử dụng fructose. Maltose sẽ đ−ợc biến đổi thành hai phân tử đ−ờng glucose, do vậy loại đ−ờng này sẽ là nguồn dinh d−ỡng có hiệu quả hơn đối với phôi. Nhận xét này cũng t−ơng tự với kết luận của một số tác giả khi nghiên cứu vai trò kích thích của đ−ờng maltose trong quá trình nuôi cấy các tế bào sinh dục của các cây ngũ cốc.
Việc xác định đúng vị trí đặt phôi trên môi tr−ờng nuôi cấy là rất cần thiết đối với sự sinh tr−ởng bình th−ờng của phôi. Trong tự nhiên, tế bào scutellum tiếp xúc trực tiếp với nguồn dinh d−ỡng: nội nhũ. Việc tiếp xúc trực tiếp của các tế bào
scutellum với lớp tế bào d−ới sẽ dẫn tới việc cung cấp đầy đủ dinh d−ỡng từ môi tr−ờng cho phôi.
Một yếu tố quan trọng cuối cùng đó là ảnh h−ởng của kiểu gen lên sự phát triển của phôi. A188 đ−ợc xem nh− là kiểu gen thích hợp cho nuôi cấy in vitro
(Armstrong và Green, 1985) [20].
Để tránh sử dụng phôi non, Zhong & CS (1992) [120] đã tạo cụm chồi thành công với tần số cao từ chồi đỉnh của các cây con nảy mầm từ hạt trong điều kiện in vitro. 36 dòng ngô khác nhau đã đ−ợc thí nghiệm bằng ph−ơng pháp này và tần số tái sinh dao động từ 24% đến 97%. Hệ thống tái sinh cây từ chồi đỉnh này cũng đã đ−ợc áp dụng thành công trong các nghiên cứu cải thiện di truyền ở ngô. Zhong & CS (1996) [18] đã tái sinh hiệu quả các cây ngô chuyển gen bằng ph−ơng pháp bắn gen sử dụng chồi đỉnh. Cũng t−ơng tự, O’Connor-Sánchez & CS (2002) [80] đã nhận đ−ợc các cây chuyển gen của các dòng ngô nhiệt đới và cận nhiệt đới bằng cách bắn gen vào các mô sẹo đã biệt hoá và các mô sẹo phôi hoá tạo thành từ chồi đỉnh. Zhang & CS (2002) [119] cũng đã chuyển gen vào các tế bào mô phân sinh chồi nhận đ−ợc từ các cây con nảy mầm từ hạt của các dòng ngô thuần bằng ph−ơng pháp bắn gen. Sairam & CS (2003) [90] cũng đã thu đ−ợc các cây ngô chuyển gen bằng cách lây nhiễm trực tiếp mô phân sinh chồi đỉnh với các chủng vi khuẩn
Agrobacterium mang vectơ chứa gen gfp.
Các nghiên cứu tái sinh cây thông qua mô sẹo tạo thành từ phôi tr−ởng thành đã đ−ợc thực hiện ở các cây ngũ cốc (Rueb & CS, 1994; Ozgen & CS, 1998; Akula & CS, 1999; Ward & Jordan, 2001) [89], [81], [18], [117]. Green & CS (1974) [59] lần đầu tiên đã báo cáo về sự hình thành mô sẹo từ phôi ngô tr−ởng thành, tuy nhiên họ đã không tái sinh đ−ợc cây. Việc sử dụng phôi tr−ởng thành tách từ hạt khô làm nguồn vật liệu ban đầu có nhiều −u điểm hơn so với phôi non: phôi dễ tách, có thể có số l−ợng lớn cho mỗi thí nghiệm và chủ động hơn trong việc cung cấp nguồn vật liệu. Tuy nhiên, tái sinh cây từ phôi tr−ởng thành sẽ khó hơn từ phôi non. Wang (1987) [116] đã tái sinh cây thành công từ phôi tr−ởng thành của hai dòng ngô B73 và Mo17, nh−ng khả năng tái sinh phụ thuộc nhiều vào kiểu gen và tần số tái sinh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
rất thấp (chỉ đạt 4-5%), đối với dòng ngô A632 đã không thu đ−ợc cây tái sinh. Tiếp theo đó, Huang & Wei (2004) [66] đã tái sinh cây thành công từ phôi tr−ởng thành của 7 dòng ngô thuần với tần số t−ơng đối cao (dao động từ 19,8% đến 32,4%), và đặc biệt với dòng Mo17 đạt 25,6%. So sánh với khả năng tái sinh rất cao của các cụm chồi nhân từ chồi đỉnh, tần số tái sinh cây từ mô sẹo phôi hoá tạo thành từ phôi tr−ởng thành vẫn còn thấp hơn (Huang & Wei, 2004) [66].