Hình 35. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đã đ−ợc chuyển gen nptII. Cột M: Thang ADN chuẩn 1kb;
Cột 1-6, 9-13, 15-17: Cây đã chuyển gen (với sự có mặt của gen nptII); Cột 7,8,14: Cây không đ−ợc chuyển gen
Cột (-): Cây đối chứng (cây tái sinh từ phôi non không chuyển gen); Cột H2O: Mẫu đối chứng H2O (không có ADN);
Cột (+): ADN plasmid pBINGUSINT (mang gen nptII)
Hình 36. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đã đ−ợc chuyển gen thông qua Agrobacterium
Cột M: Thang ADN chuẩn 1kb;
Cột 1-17: Cây chuyển gen (không có gen vir của vi khuẩn Agrobacterium); Cột (-): Cây đối chứng (cây tái sinh từ phôi non không chuyển gen); Cột H2O: Mẫu đối chứng H2O (không có ADN);
Trên cơ sở kết quả phân tích PCR của các cây chuyển gen thu đ−ợc, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật lai Southern để kiểm tra sự dung nạp của các gen đã chuyển trong hệ gen thực vật. Kết quả phân tích lai ADN của 9 dòng ngô HR8 chuyển gen
pat nhận đ−ợc từ 6 thí nghiệm đ−ợc trình bày ở hình 37 và 38.
ADN tổng số đã đ−ợc xử lý với enzym NcoI hoặc SacI hoặc không đ−ợc cắt bởi enzym giới hạn, phân tách bằng điện di trên gel agarose 0,8%. ADN đã đ−ợc thấm tách lên màng nylon và lai với mẫu dò (đã đ−ợc đánh dấu bởi α-32P-dCTP); 4,7 pg plasmid ADN p35PAT đ−ợc cắt bởi SacI làm đối chứng. Raoul marker đ−ợc sử dụng làm thang ADN chuẩn (cột M).
Đoạn ADN nhận đ−ợc sau khi cắt với NcoI có kích th−ớc 1.1kbp cho thấy các dòng HR8 chuyển gen có chứa ít nhất 1 bản sao nguyên vẹn của cấu trúc gen
pat và đoạn khởi động CaMV35S (hình 37).
Hình 37. Kết quả lai DNA của các dòng ngô HR8 chuyển gen pat (cắt bằng NcoI). 10ug ADN tổng số tách từ các cây HR8 không đ−ợc chuyển gen (đối chứng) (cột 1) vμ 5 dòng HR8 chuyển gen đ−ợc cắt bởi NcoI (cột 2,3,4,5,6), phân tách bằng điện di trên gel agarose 0,8% vμ lai với mẫu dò 35S-pat 1.1kbp đã đ−ợc đánh dấu bởi α-32P-dCTP; 4,7 pg plasmid ADN p35PAT đ−ợc cắt bởi SacI (cột con.). Raoul marker đ−ợc sử dụng lμm thang ADN chuẩn (cột M).
Số vạch ADN nhận đ−ợc sau khi cắt với SacI (enzym giới hạn chỉ cắt 1 lần ở 1vị trí bên trong trình tự gen pat) cho thấy số bản sao của gen đã chuyển pat trong genom của cây ngô. Phân tích phân tử các dòng chuyển gen cho thấy dạng kết hợp của ADN nhận đ−ợc rất đặc tr−ng cho ph−ơng pháp chuyển gen trực tiếp (bắn gen), số bản sao của gen chuyển dao động từ 1 đến 4. Trong số 10 dòng chuyển gen nhận đ−ợc mang gen pat, có 7 dòng chuyển gen có chứa 1-2 bản copy và 3 dòng mang 3- 4 bản copy của gen chuyển (hình 38).
3.4.4.2. Phân tích lai Southern các dòng ngô GA35 chuyển gen nptII
Các dòng ngô GA35 chuyển gen nhận đ−ợc từ các thí nghiệm biến nạp với
Agrobacterium ATHVpBINGUSINT (bảng 34) cũng đã đ−ợc phân tích bằng kỹ thuật lai Southern.
ADN tổng số đ−ợc tách từ các cây chuyển gen đã đ−ợc xử lý với enzym
HindIII (cột 3,5,7,9,11,13) hoặc không đ−ợc cắt bởi enzym này (cột 4,6,8,10,12), Hình 38. Kết quả lai DNA của các dòng ngô HR8 chuyển gen pat (cắt bằng SacI). Cây HR8 không đ−ợc chuyển gen (đối chứng) (cột 19) vμ 9 dòng HR8 chuyển gen đ−ợc cắt bởi SacI (cột 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17) vμ không đ−ợc cắt bởi enzym giới hạn (cột 18,16,14,12,10,8,6,4,2); plasmid ADN p35PAT (cột 20). Raoul marker (cột M).
phân tách bằng điện di trên gel agarose 0,8%. ADN đã đ−ợc thấm tách lên màng nylon và lai với mẫu dò gen nptII đã đ−ợc đánh dấu bởi α-32P-dCTP; 0,7 pg plasmid ADN pBINGUSINT đ−ợc cắt bởi HindIII làm đối chứng (cột 1). Raoul marker đ−ợc sử dụng làm thang ADN chuẩn (cột M). Kết quả phân tích lai ADN đ−ợc trình bày ở hình 39.
Số vạch ADN nhận đ−ợc sau khi cắt với HindIII (enzym giới hạn chỉ cắt 1 lần ở 1vị trí bên trong gen nptII) cho thấy số bản sao của gen đã chuyển nptII trong genom của cây ngô. Trong số 6 dòng chuyển gen nhận đ−ợc mang gen nptII, chúng tôi chỉ có 2 dòng chuyển gen mang 2 bản copy của gen chuyển (cột 7 và 13), các dòng còn lại đều mang 1 bản copy (hình 39).
Các dòng ngô GA35 chuyển gen này đã đ−ợc chuyển ra đất trồng và đã thu đ−ợc hạt R1 (hình 40).
Hình 39. Kết quả lai Southern của các dòng ngô GA35 chuyển gen nptII. 10ug ADN tổng số tách từ các cây GA35 không đ−ợc chuyển gen (đối chứng) (cột 2) vμ 6 dòng GA35 chuyển gen đ−ợc cắt bởi HindIII (cột 3, 5, 7, 9, 11, 13) vμ không đ−ợc cắt bởi enzym giới hạn (cột 4, 6, 8, 10, 12), phân tách bằng điện di trên gel agarose 0,8% vμ lai với mẫu dò gen nptII 550bp đã đ−ợc đánh dấu bởi α-32P-dCTP. 0,7 pg plasmid ADN pBINGUSINT đ−ợc cắt bởi HindIII (cột 1). Raoul marker đ−ợc sử dụng lμm thang ADN chuẩn (cột M).
Hầu hết các dòng GA35 chuyển gen khi chuyển ra trồng trong đất đều biểu hiện kiểu hình bình th−ờng và hữu thụ (hình 40). Chúng tôi đã nhận đ−ợc hạt R1 của 3 dòng GA35 chuyển gen tự thụ (hình 40.4) và hạt R1 của 6 dòng lai giữa dòng GA35 chuyển gen với dòng GA35 không chuyển gen (trồng từ hạt). Các dòng GA35 chuyển gen này sẽ đ−ợc tiếp tục trồng, đánh giá sự phân ly của các gen đã chuyển trong các thế hệ sau.
3.4.5. Thử nghiệm cây chuyển gen trong nhà kính
Các dòng ngô HR8 chuyển gen gfp và pat đã đ−ợc chuyển ra đất trồng. Chúng tôi đã đánh giá biểu hiện của gen kháng thuốc diệt cỏ (pat) trong các cây
Hình 40. Dòng ngô GA35 chuyển gen hữu thụ trồng trong nhμ kính (1, 2); Bắp ngô chuyển gen GA35 (thế hệ R1) (3, 4);
1 2
chuyển gen bằng cách phun dung dịch Basta (250mg/l PPT) lên lá của các cây này ở giai đoạn 2-3 lá mới xuất hiện sau khi chuyển ra đất. Số lần phun 3 lần, cứ 2 ngày phun 1 lần.
Theo dõi khả năng sinh tr−ởng, phát triển và đánh giá biểu hiện bền vững của gen đã chuyển ở các dòng HR8 chuyển gen trồng trong nhà kính đ−ợc tóm tắt ở bảng 35.
Bảng 35. Theo dõi sinh tr−ởng vμ phát triển của các dòng HR8 chuyển gen trồng trong nhμ kính
Ký hiệu Kết quả phân tích PCR Mức độ kháng basta Khả năng ST&PT B6/HR8/1 + +++ tự thụ B6/HR8/8 - - biến dị B7/HR8/1 + ++ tự thụ B7/HR8/4 + + Có bắp muộn, x HR8 B7/HR8/11 + ++ Có bắp muộn, x HR8 B9/HR8/1 + + Cờ lép, không có phấn, x HR8 B9/HR8/3 + ++ tự thụ B11/HR8/1 + +++ tự thụ B11/HR8/2 + + Có bắp muộn, x HR8 B11/HR8/4 + ++ Cờ lép, không có phấn, x HR8 B12/HR8/5 + + Cờ lép, không có phấn, x HR8 B15/HR8/5 + - Có bắp muộn, x HR8 B15/HR8/6 + +++ Tự thụ (+++): mức độ kháng rất tốt (++): mức độ kháng trung bình (+): mức độ kháng yếu
1 2
3 4 5
Hình 41. Đánh giá biểu hiện bền vững của gen pat ở các dòng ngô HR8 chuyển gen trồng trong nhμ
kính. 1, 2. Biểu hiện kháng thuốc diệt cỏ của các dòng chuyển gen (3 ngμy vμ 6 ngμy sau khi phun dung dịch basta) 3. Lá của cây ngô không chuyển gen vμ cây chuyển gen sau khi xử lý dung dịch basta; 4,5,6. Các dòng ngô HR8 chuyển gen hữu thụ trồng trong đất (thế hệ R1 tự thụ); 7. Các dòng ngô lai giữa dòng mẹ HR8 bình th−ờng với dòng HR8 chuyển gen (thế hệ lai R1 ).
Mức độ biểu hiện của gen kháng thuốc diệt cỏ đã đ−ợc quan sát thấy rất khác nhau ở các dòng HR8 chuyển gen. Kết quả sau 7 ngày phun dung dịch basta, ở các cây đối chứng (cây tái sinh từ phôi non không đ−ợc bắn gen) và cây tái sinh không đ−ợc chuyển gen tất cả lá đều héo rũ, cây chết, các cây đ−ợc chuyển gen pat vẫn phát triển bình th−ờng (hình 41.1-41.2).
Chúng tôi đã nhận đ−ợc 10 dòng ngô HR8 có khả năng kháng thuốc diệt cỏ tốt, lá xanh, cây phát triển bình th−ờng và đã thu đ−ợc hạt thế hệ R1 (hình 42.5- 42.7).
Hầu hết các cây chuyển gen tái sinh khi chuyển ra trồng trong đất đều biểu hiện kiểu hình bình th−ờng. Một số cây tái sinh biểu hiện sự thay đổi về kiểu hình, nh− giảm chiều cao, xuất hiện nhiều bắp, hoặc hình thành bắp lẫn với cờ. Ngoài ra, trong một số tr−ờng hợp, hạt của các dòng chuyển gen nhận đ−ợc bằng cách thụ phấn chéo hoặc thụ phấn với cây trồng từ hạt của dòng mẹ không đ−ợc chuyển gen (hình 41.7).
3.4.6. Kết luận
• áp dụng quy trình biến nạp gen bằng súng bắn gen đã đ−ợc hoàn thiện, chúng tôi đã tạo đ−ợc 10 dòng ngô HR8 chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ. Các dòng chuyển gen này đã đ−ợc phân tích sự có mặt của các gen đã chuyển bằng các ph−ơng pháp sinh học phân tử. Biểu hiện bền vững của các gen gfp và pat đã đ−ợc đánh giá ở các dòng chuyển gen trồng trong nhà kính. Đã thu đ−ợc hạt thế hệ R1 của các dòng chuyển gen này.
• Sử dụng dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao GA35 đã chọn tạo đ−ợc và quy trình biến nạp gen thông qua Agrobacterium đã đ−ợc thiết lập, chúng tôi đã tạo ra 6 dòng ngô GA35 chuyển gen bền vững mang gen nptII. Sự có mặt của các gen đã chuyển trong các dòng ngô GA35 chuyển gen này đã đ−ợc phân tích. Đã thu đ−ợc hạt thế hệ R1 của các dòng chuyển gen này.
Ch−ơng 4.
Tổng quát hoá vμ đánh giá kết quả thu đ−ợc
Trong thời gian 3 năm từ tháng 1/2002 đến hết tháng 12/2004 đề tài đã thu đ−ợc các kết quả sau:
4.1. Kết quả về khoa học
7. Lần đầu tiên đã xây dựng và hoàn thiện quy trình tái sinh cây từ phôi ngô non trên cơ sở tối −u hoá ảnh h−ởng của một số yếu tố chính. Quy trình tái sinh cây có hiệu quả cao, có thể áp dụng đ−ợc với các dòng/giống ngô khác nhau trong điều kiện Việt Nam.
8. Đã hoàn thiện quy trình tái sinh phôi tạo thành từ nuôi cấy bao phấn ngô. Hiệu quả tái sinh cây từ phôi tạo thành đã đ−ợc cải thiện bằng việc tối −u hoá môi tr−ờng và quy trình nuôi cấy.
9. Đã đánh giá đ−ợc khả năng tái sinh từ phôi non và phản ứng nuôi cấy bao phấn của m−ời dòng ngô Việt nam GA, GB, G35, G2, G3, G5, GC2, GC8, GS3, GX2. Đã chọn đ−ợc dòng GC8 có khả năng tái sinh từ phôi non cũng nh− từ nuôi cấy bao phấn t−ơng đối tốt.
10.Đã chọn tạo đ−ợc 5 dòng ngô có khả năng tái sinh cao GAB, GA35, GCA8, GH35 và GCH8 bằng ph−ơng pháp lai hữu tính kết hợp tái sinh cây từ phôi non giữa các dòng ngô Việt Nam có phản ứng thấp trong nuôi cấy phôi non với các dòng ngô nhập nội HR8/HR9. Các dòng ngô này có khả năng tái sinh cao, thích ứng với các điều kiện tự nhiên của Việt Nam, hoàn toàn có thể sử dụng thay thế dòng nhập nội làm nguồn vật liệu ban đầu cho các nghiên cứu biến nạp gen. 11. Đã xây dựng và hoàn thiện quy trình chuyển gen bằng súng bắn gen vào ngô.
Các yếu tố chính ảnh h−ởng đến hiệu quả biến nạp đã đ−ợc nghiên cứu tối −u hoá.
12. Đã xây dựng và hoàn thiện quy trình biến nạp gen ở ngô thông qua vi khuẩn
13. Sử dụng các quy trình biến nạp gen đã đ−ợc hoàn thiện, đề tài đã tạo đ−ợc 10 dòng ngô HR8 mang gen kháng thuốc diệt cỏ bằng súng bắn gen và 6 dòng ngô GA35 mang gen nptII bằng ph−ơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium. Đã thu đ−ợc hạt R1 của các dòng ngô chuyển gen này.
14. Đã chuyển các gen mang các đặc tính quan trọng: chín sớm, chịu lạnh vào ngô thông qua Agrobacterium. Sự có mặt và biểu hiện của các gen này trong các dòng ngô chuyển gen sẽ đ−ợc đánh giá.
Kết quả đạt đ−ợc của đề tài
TT Tên sản phẩm và chỉ tiêu chất l−ợng chủ yếu Đơn vị đo Khối l−ợng theo thuyết minh Kết quả đạt đ−ợc Ghi chú (1) (2) (3) (4) (5) (6) 1 Các dòng ngô có khả năng tái sinh cao thích hợp cho chuyển gen trong điều kiện Việt nam
dòng 2-3 05
V−ợt mức 2 dòng so với kế hoạch dự kiến
2 Dòng ngô mang gen chín sớm
dòng 1-2 08
3 Dòng ngô mang gen chịu lạnh dòng 1-2 09 Sự có mặt của gen chuyển nạp ch−a phân tích đ−ợc do vectơ thiết kế ch−a hoàn chỉnh
4 Dòng ngô mang gen tăng c−ờng hấp thụ nitơ sớm
dòng 1-2 - Ch−a thực hiện đ−ợc do phía Đức ch−a cung cấp gen và vectơ
5 Quy trình tái sinh từ phôi ngô non hiệu quả cao
QT
1 1
6 Quy trình tái sinh phôi tạo thành từ nuôi cấy bao phấn
QT
(1) (2) (3) (4) (5) (6) 7 Quy trình chuyển
gen vào ngô bằng súng bắn gen
QT
1 1
8 Quy trình chuyển gen vào ngô thông qua Agrobacterium
QT
1 1
9 Dòng ngô mang gen kháng thuốc diệt cỏ
dòng Không bắt buộc 10 10 Dòng ngô mang gen
nptII
dòng Không bắt buộc
6
Quy trình biến nạp gen đã đ−ợc hoàn thiện và thu nhận đ−ợc các dòng ngô chuyển gen bền vững
4. 2. Kết quả nổi bật vμ khả năng áp dụng
Đây là dự án chuyển gen vào cây ngô đ−ợc tiến hành lần đầu tiên ở n−ớc ta. Dự án đã thực hiện tốt các nội dung nghiên cứu đặt ra và đã thu đ−ợc những kết quả b−ớc đầu rất khả quan.
Kết quả nổi bật của đề tài thực hiện từ tháng 1/2002-12/2004
TT Tên sản phẩm Đơn vị Chỉ tiêu chất l−ợng Kết quả đạt đ−ợc (1) (2) (3) (4) (5) 1 Dòng ngô có khả năng tái sinh cao
Dòng Các chỉ tiêu tái sinh cây
Tạo đ−ợc 5 dòng FNBcr2: GAB, GA35, GCA8, GH35 và GCH8 có khả năng tái sinh cao, sinh tr−ởng tốt trong điều kiện Việt Nam
2 Hệ thống tái sinh cây phục vụ cho biến nạp gen
Quy trình
- Quy trình tái sinh cây từ phôi non có thể áp dụng đ−ợc với các giống ngô khác nhau
- Quy trình tái sinh phôi tạo thành từ bao phấn
3 Các dòng ngô chuyển gen Các chỉ tiêu biểu thị gen chuyển nạp
-10 dòng ngô R1 (HR8) mang gen kháng thuốc diệt cỏ và 6 dòng ngô R1 (GA35) mang gen kháng kanamycin nptII
(1) (2) (3) (4) (5) 4 Công nghệ
chuyển gen vào cây trồng trong điều kiện Việt Nam
- Chuyển gen bằng súng bắn gen đối với cây ngô
- Chuyển gen thông qua
Agrobacterium đối với cây ngô
Đề tài đã hoàn thành tốt các nội dung công việc nh− đã dự kiến trong Thuyết minh đề tài, cụ thể nh− sau:
1. Đã xây dựng và hoàn thiện quy trình tái sinh cây có hiệu quả cao từ phôi ngô non, có thể áp dụng đ−ợc với các dòng/giống ngô khác nhau trong điều kiện Việt Nam. Đây là một trong những kết quả quan trọng làm tiền đề cho các đề tài chuyển gen vào ngô về sau này.
2. Đã hoàn thiện quy trình tái sinh phôi tạo thành từ nuôi cấy bao phấn ngô.
3. Kết quả đề tài đã chọn tạo đ−ợc 5 dòng ngô có khả năng tái sinh cao GAB, GA35, GCA8, GH35 và GCH8, v−ợt kế hoạch so với đăng ký trong thuyết minh của đề tài 2 dòng. Các dòng ngô này có khả năng tái sinh cao, thích ứng với các điều kiện tự nhiên của Việt Nam, hoàn toàn có thể sử dụng thay thế dòng nhập nội làm nguồn vật liệu ban đầu cho các nghiên cứu biến nạp gen.
4. Xây dựng và hoàn thiện quy trình chuyển gen bằng súng bắn gen vào ngô. 5. Hoàn thiện quy trình biến nạp gen ở ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium. 6. Đề tài đã tạo đ−ợc 16 dòng ngô chuyển gen bền vững bằng cả hai ph−ơng pháp
biến nạp: súng bắn gen và Agrobacterium. Các dòng ngô chuyển gen này đã đ−ợc phân tích bằng các ph−ơng pháp sinh học phân tử và biểu hiện bền vững của các gen chuyển đã đ−ợc đánh giá trong điều kiện nhà kính. Đã thu đ−ợc hạt R1 của các dòng chuyển gen này. Kết quả này cho thấy các quy trình biến nạp gen mà đề tài xây dựng đã đ−ợc áp dụng thành công trong điều kiện Việt Nam.
7. Các gen mang các đặc tính quan trọng: chín sớm, chịu lạnh đã đ−ợc chuyển vào ngô thông qua Agrobacterium. Sự có mặt và biểu hiện của các gen này trong các dòng ngô chuyển gen sẽ đ−ợc đánh giá.
4.3. trình độ công nghệ
- Lần đầu tiên ở Việt Nam đã hoàn thiện quy trình tái sinh cây từ phôi non có hiệu quả cao, tạo nguồn vật liệu cho biến nạp gen vào ngô. Quy trình đ−ợc áp dụng đối với các kiểu gen ngô khác nhau.
- Trình độ công nghệ về chuyển gen vào thực vật, phân tích đánh giá cây chuyển gen đã đạt trình độ quốc tế. Số liệu, hình ảnh thu đ−ợc đáng tin cậy.