Trên cơ sở nghiên cứu các yếu tố chính ảnh h−ởng đến hiệu quả biểu hiện gen tạm thời, chúng tôi đã hoàn thiện quy trình biến nạp gen vào ngô bằng súng bắn gen nh− sau:
Chuẩn bị mẫu mô đích:
Bắp sau khi thụ phấn khoảng 18-20 ngày đ−ợc thu để tách phôi. Phôi non đ−ợc cấy trên môi tr−ờng tạo mô sẹo CN6 với phần tế bào scutellum h−ớng lên trên, phần trụ phôi tiếp xúc với bề mặt môi tr−ờng, nuôi trong tối ở 25oC, thời gian 5-7 ngày.
Chuyển phôi tiền nuôi cấy sang môi tr−ờng xử lý áp suất thẩm thấu OsM, nuôi trong tối ở 25oC , thời gian 5 giờ.
Chuẩn bị mẫu DNA plasmid và hạt vàng:
DNA plasmid đ−ợc tách từ vi khuẩn E. coli mang vectơ plasmid chứa gen cần chuyển và tinh sạch theo ph−ơng pháp của Sambrook & CS, (2001) [91].
1mg hạt vàng kích th−ớc 0,6μm đ−ợc bọc bởi 5μg DNA plasmid theo ph−ơng pháp của Sanford, 1993. L−ợng hạt vàng đ−ợc bọc bởi DNA plasmid này đ−ợc sử dụng để bắn cho 6 đĩa mẫu.
Bắn gen:
Các thông số bắn
• áp lực bắn: 1350psi
• Plasmid bọc hạt vàng kích th−ớc 0,6μm
Sau khi bắn giữ phôi trên môi tr−ờng OsM trong tối ở 25oC , thời gian 20h (qua đêm)
Giai đoạn phục hồi
Chuyển phôi đã bắn gen từ môi tr−ờng OsM sang môi tr−ờng CN6, nuôi trong tối ở 25oC , thời gian 10 ngày
Chọn lọc mô sẹo chuyển gen
Mô sẹo tạo thành từ phôi non bắn gen trên môi tr−ờng CN6 đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng ECM có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật t−ơng ứng, nuôi trong tối ở 25oC, thời gian 20 ngày.
Tạo chồi chuyển gen
Mô sẹo phôi hoá tạo thành trên môi tr−ờng chọn lọc ECM đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng SM có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật thích hợp, để tái sinh chồi, nuôi sáng ở 25oC, thời gian 20 ngày.
Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh
Chồi tái sinh trong môi tr−ờng chọn lọc SM đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng tạo cây hoàn chỉnh RM có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật thích hợp, nuôi sáng ở 25oC , thời gian 10-20 ngày.
Chuyển cây ra đất
Cây tái sinh trên môi tr−ờng chọn lọc RM có 2-3 lá, 3-4 rễ đ−ợc chuyển ra đất trồng.
Phân tích cây chuyển gen
Khi cây chuyển gen tái sinh trồng trên đất xuất hiện khoảng 2-3 lá mới, tiến hành thu mẫu lá để thực hiện các phân tích sau:
• PCR
• Lai DNA Southern Blot
3.2. Xây dựng hệ thống chuyển gen