Chuyển gen bằng súng bắn gen là một trong những kỹ thuật đ−a trực tiếp các gen ngoại lai vào tế bào (Sanford, 1990) [92]. Ph−ơng pháp này đ−ợc áp dụng với những giống cây trồng mà việc chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium khó thực hiện đ−ợc (do các loài này không mẫn cảm với Agrobacterium hay khả năng tái sinh kém) (Brown & CS, 1994) [30]. Ph−ơng pháp này đ−ợc sử dụng t−ơng đối rộng rãi (Finer & CS, 1992; Casas & CS, 1995) [50] [33] với các −u và nh−ợc điểm sau:
Ưu điểm:
- Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô, tế bào.
- Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào nhanh.
- Dễ sử dụng: quy trình đơn giản, một số l−ợng lớn mẫu có thể đ−ợc xử lý trong thời gian ngắn.
- Các vectơ đ−ợc thiết kế đơn giản: không đòi hỏi các trình tự DNA cho đoạn T-DNA nh− chuyển gen bằng Agrobacterium.
- Cần một l−ợng nhỏ plasmid DNA.
- Biểu hiện gen tạm thời có thể đ−ợc quan sát sau vài ngày.
Nh−ợc điểm:
- Nhiều bản sao đ−ợc chuyển vào tế bào cùng một lúc, gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen đã chuyển, dẫn tới sự biểu hiện của các gen không bền vững (Hadi & CS, 1996) [61].
3.3. Xây dựng Hệ thống chuyển gen
3.3.1. Xây dựng hệ thống chuyển gen bằng súng bắn gen
3.3.1.1. Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen bằng súng bắn gen
3.3.1.2. Vật liệu và ph−ơng pháp
3.3.1.3. Hoàn thiện quy trình chuyển gen bằng súng bắn gen
3.3.1.4. Kết luận
- Hiệu quả chuyển gen thấp.
áp dụng ph−ơng pháp chuyển gen này với các loài cây một lá mầm ng−ời ta đã thu đ−ợc cây chuyển gen hữu thụ ở lúa (Christou & CS, 1991) [39], lúa mạch (Wan &Lemaux 1995) [115], lúa mỳ (Becker & CS, 1994) [23] và đặc biệt là ngô (Wan & CS, 1995; Songstad & CS, 1996; Brettschneider & CS, 1997; Bohorova & CS, 1999; Frame & CS, 2000; Aulinger & CS, 2002) [115] [100] [28] [26] [52] [22]. Một hệ thống chuyển gen hiệu quả đòi hỏi tế bào thực vật sau khi đ−ợc biến nạp phải có khả năng tái sinh tốt. Các yếu tố tác động đến quá trình chuyển gen cần đ−ợc phân tích với 2 khía cạnh: biểu hiện gen tạm thời và khả năng tái sinh sau khi biến nạp gen.
Các dạng mô khác nhau đã đ−ợc sử dụng làm mô đích cho biến nạp gen bằng súng bắn gen ở ngô. Tần số biến nạp của các hệ thống chuyển gen này khác nhau rất nhiều. D−ới đây là một số hệ thống nuôi cấy chính đã đ−ợc sử dụng:
• Biến nạp gen vào tế bào huyền phù và tế bào mô sẹo dạng II
Hiệu quả chuyển gen vào tế bào huyền phù và tế bào mô sẹo dạng II đ−ợc đánh giá thông qua số cây chuyển gen nhận đ−ợc từ một đĩa bắn. Nghiên cứu của Walters & CS, (1992) [114] khi biến nạp gen vào tế bào mô sẹo ngô dạng II đã thu đ−ợc 1 cây chuyển gen từ 7-10 đĩa bắn; trong khi đó nhiều hơn 1 cây chuyển gen/đĩa bắn đã nhận đ−ợc trong các thí nghiệm của Gordon-Kamm & CS, (1990) [55]. Các kết quả này cho thấy tần số chuyển gen vào mô sẹo dạng II dao động rất nhiều. Mặt khác, hệ thống chuyển gen thông qua mô sẹo dạng II có nh−ợc điểm là phụ thuộc nhiều vào kiểu gen thực vật và mất nhiều thời gian cho quá trình hình thành và duy trì mô sẹo có khả năng tái sinh. Hơn nữa, các cây tái sinh có biểu hiện thay đổi về kiểu hình, đặc biệt là không có khả năng hữu thụ (Gordon-Kamm & CS, 1990; Fromm & CS, 1985) [55], [53].
• Biến nạp gen vào tế bào mô sẹo dạng I
Wan & CS (1995) [114] đã thu đ−ợc tần số chuyển gen cao khi sử dụng mô sẹo 10 tháng tuổi tạo thành từ nuôi cấy bao phấn. Trung bình 2 dòng mô sẹo chuyển gen đã nhận đ−ợc từ 1 đĩa bắn. So sánh với mô sẹo dạng II, mô sẹo dạng I đ−ợc tạo
thành từ hầu hết các dòng ngô và có khả năng tái sinh sau thời gian nuôi cấy dài hơn. Ngoài ra, Wan & CS cũng nhận xét rằng sử dụng mô sẹo làm mô đích cho bắn gen có −u điểm là không phụ thuộc vào biến động của mùa màng cũng nh− điều kiện nuôi trồng vật liệu cho phôi. Đây là 2 yếu tố chính ảnh h−ởng nhiều tới chất l−ợng và số l−ợng của phôi soma tạo thành từ phôi non (D’Halluin & CS, 1992) [42].
• Biến nạp gen vào tế bào mô phân sinh chồi đỉnh
Lowe & CS (1985) [73] đã sử dụng mô phân sinh chồi đỉnh tách từ cây con nảy mầm từ hạt trong điều kiện in vitro làm mô đích để bắn gen. Họ đã thu đ−ợc các chồi chuyển gen khảm. Các chồi khảm này tiếp tục đ−ợc nhân lên trong môi tr−ờng có tác nhân chọn lọc cho tới khi thu đ−ợc cây chuyển gen hoàn toàn. Tuy nhiên, với một số dòng ngô thì việc tái sinh cây từ chồi đỉnh vẫn gặp khó khăn (Lowe & CS (1985) [73]. Nh−ợc điểm của hệ thống tế bào đích này là tỷ lệ cây đ−ợc chuyển gen hoàn toàn thấp, thời gian để tái sinh cây chuyển gen lâu.
• Biến nạp gen vào tế bào phôi non
Hầu hết các nghiên cứu biến nạp gen bằng súng bắn gen ở các loài cây ngũ cốc đã thành công khi sử dụng phôi non làm mô đích. ậ lúa mỳ, tần số chuyển gen đạt đ−ợc 1 cây/500-1000 phôi, 1 cây/80 phôi (Becker & CS, 1994) [23] và 1 cây/50 phôi (Vasil & CS, 1993) [111]. Cho đến nay, tần số chuyển gen cao nhất đã nhận đ−ợc: ở lúa (1/1,3), lúa mạch (1/23) (Wan & Lemaux 1995) [115] và lúa mỳ (1/30; Zimny & CS, 1995) [121] và ngô (1%) Koziel & CS (1993).
Một kết quả đáng chú ý nhất đó là nghiên cứu của Brettschneider & CS (1997) [28] khi bắn gen vào phôi non dòng ngô H99 đã có đ−ợc tần số t−ơng đối cao, 3%. Các cây chuyển gen dã nhận đ−ợc ở cả 3 dòng ngô thuần và các dòng lai giữa chúng.
So sánh hiệu quả biến nạp giữa các hệ thống tế bào đích khác nhau cho thấy phôi non là dạng mô đích thích hợp nhất cho các nghiên cứu chuyển gen ở ngô. Tuy nhiên, một hạn chế lớn khi sử dụng hệ thống này là sự không ổn định về số l−ợng
cũng nh− chất l−ợng của vật liệu ban đầu (phôi non) do tác động của thời tiết cũng nh− điều kiện nuôi trồng vật liệu cho phôi.
3.2.1.2. Vật liệu và ph−ơng pháp
3.2.1.2.1. Vật liệu
Vật liệu thực vật
Vật liệu sử dụng trong các thí nghiệm là phôi đ−ợc tách từ các bắp non của dòng ngô nhập nội HR8 (do Viện Công nghệ liên bang ETH, Thuỵ sỹ cung cấp). Các cây ngô mẹ cho bắp thí nghiệm đ−ợc trồng trong nhà l−ới vào các vụ đông và vụ xuân năm 2003-2005.
Plasmid
• Plasmid pDB1 (Becker & CS, 1994) [23]: mang gen chỉ thị gus mã hoá cho protein β-glucuronidase đ−ợc điều khiển bởi promoter actin-1 và gen chọn lọc bar
đ−ợc điều khiển bởi promoter CaMV 35S (hình 11.1). Plasmid này đ−ợc sử dụng trong các thí nghiệm tối −u hoá quy trình biến nạp gen.
• Plasmid pSLGUSINTPAT: mang gen chỉ thị gus mã hoá cho protein β- glucuronidase đ−ợc điều khiển bởi promoter CaMV 35S và gen chọn lọc pat đ−ợc điều khiển bởi promoter CaMV 35S (hình 11.2).
• Plasmid pAHC25 (Christensen và Quail, 1996) [38]: mang gen chỉ thị gus mã hoá cho protein β-glucuronidase đ−ợc điều khiển bởi promoter ubiquitin và gen chọn lọc bar đ−ợc điều khiển bởi promoter CaMV 35S (hình 11.3).
Các plasmid này do Đại học Tổng hợp Hamburg và Công ty KWS/Planta (CHLB Đức) cung cấp.
Chúng tôi sử dụng hệ thống chuyển gen PDS 1100/He (BioRad, USA) để tiến hành các thí nghiệm bắn gen. Hạt vàng có kích th−ớc 0.6àm hoặc1àm (BioRad, Đức) đ−ợc bọc bởi 5 ug DNA plasmid theo quy trình của Sanford (1993) [93].
3.2.1.2.2. Ph−ơng pháp
Phôi non sau thụ phấn 20 ngày đ−ợc tách trong điều kiện vô trùng. Phôi non sau khi bắn gen đ−ợc nuôi cấy, tạo mô sẹo và tái sinh cây theo quy trình đã đ−ợc xây dựng (ch−ơng 1, phần 3.1.1.4)
a) Các môi tr−ờng nuôi cấy và biến nạp đ−ợc sử dụng nh− sau (phụ lục 1, bảng 1.3):
• Môi tr−ờng tạo mô sẹo (CN6)
• Môi tr−ờng xử lý áp suất thẩm thấu (OsM)
• Môi tr−ờng tạo mô sẹo phôi hoá (ECM)
• Môi tr−ờng tái sinh chồi (SM)
• Môi tr−ờng tạo cây hoàn chỉnh (RM)
b) Tách ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli
Hình 11. Sơ đồ cấu trúc các plasmid sử dụng trong các thí nghiệm biến nạp gen bằng súng bắn gen. 1. Plasmid pDB1; 2. plasmid pSLGUSINTPAT; 3. plasmid pAHC 25.
1
3
ADN plasmid đ−ợc tách, tinh sạch theo quy trình của Sambrook & CS, (2001) [91] có cải tiến (phụ lục 2).
c) Kỹ thuật bọc hạt vàng
Các phần tử vàng đ−ợc bọc bởi DNA plasmid theo ph−ơng pháp của Sanford & CS, (1993) [93] có cải tiến (phụ lục 2).
d) Quan sát và đánh giá biểu hiện tạm thời của gen gus
Phôi sau khi bắn đ−ợc nuôi trở lại trong môi tr−ờng CN6, sau 2 ngày lấy ngẫu nhiên 10 phôi từ 1 đĩa bắn đem nhuộm trong dung dịch X-Gluc, ủ mẫu ở 370C qua đêm (Jefferson & CS, 1987) [70]. Biểu hiện tạm thời của gen gus đ−ợc quan sát d−ới kính hiển vi bằng sự xuất hiện các đốm xanh chàm trên phần scutellum của phôi bắn.
Tổng số đốm xanh chàm xuất hiện trên phần scutellum của 30 phôi nhuộm (lấy từ 3 đĩa cho 1 công thức thí nghiệm) đã đ−ợc đếm và số đốm xanh trung bình/phôi đ−ợc dùng để đánh giá mức độ biểu hiện tạm thời của gen gus. Sử dụng ch−ơng trình xử lý số liệu Excel để tính giá trị trung bình và sai số chuẩn giữa 3 lần thí nghiệm.