Các dòng ngô chuyển gen tạo đ−ợc phải đ−ợc phân tích và khẳng định là cây chuyển gen thực sự thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử. Xác định sự có mặt của gen trong tế bào cây ngô chuyển gen đ−ợc tiến hành bằng kỹ thuật PCR, với cặp mồi đặc hiệu của gen chuyển.
Lai DNA Southern Blot đ−ợc thực hiện nhằm xác định gen chuyển đ−ợc gắn vào genom của cây chuyển gen tái sinh hay không.
Mặt khác, hoạt tính gen chuyển còn đ−ợc thử bằng các phép thử chỉ thị nh−: thử tính kháng kháng sinh, thử tính kháng thuốc diệt cỏ ở quy mô phòng thí nghiệm và nhà l−ới.
2.3. Vật liệu vμ ph−ơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu
2.3.1.1. Vật liệu thực vật
Các dòng ngô đ−ợc sử dụng trong nghiên cứu gồm:
• Hai dòng ngô nhập nội HR8 và HR9 là 2 dòng có khả năng tái sinh cao, do Viện Công nghệ liên bang Thuỵ sỹ ETH cung cấp.
• 10 dòng ngô thuần của Việt nam: GA, GB, G35, G2, G3, G5, GC2, GC8, GS3, GX2, đ−ợc chọn lọc từ tập đoàn ngô của Viện Di truyền nông nghiệp.
• 10 dòng ngô lai F1: GAA (GAxHR8); GAB (GBxHR8); GA35 (G35xHR8); GA2 (G2xHR8); GA3 (G3xHR8); GA5 (G5xHR8); GCA2 (GC2xHR8); GCA8 (GC8xHR8); GSA3 (GS3xHR8); GXA2 (GX2xHR8); GCH8 (GC8xHR9); GH35 (G35xHR9); đ−ợc tạo ra trên cơ sở phép lai giữa các dòng ngô Việt Nam và dòng nhập nội HR8/HR9, trong đó dòng HR8/HR9 đ−ợc sử dụng làm dòng bố.
2.3.1.2. Các chủng vi khuẩn Agrobacterium, plasmid DNA, vật t− và hoá chất
Các chủng vi khuẩn E. coli, Agrobacterium, plasmid DNA đ−ợc sử dụng trong các thí nghiệm biến nạp gen vào cây ngô do Công ty KWS/Planta; Đại học Tổng hợp Hamburg (CHLB Đức) và Viện Công nghệ liên bang ETH, (Thuỵ sỹ) cung cấp thông qua thoả thuận chuyển giao nguyên vật liệu (MTA) gồm:
• Các chủng vi khuẩn E. coli mang plasmid pDB1; pSLGUSINTPAT; pAHC25 mang gen chỉ thị gus mã hoá cho protein β-glucuronidase và gen chọn lọc bar mã hoá cho enzym phosphynothrycin transferase mã hoá cho enzym phosphynothrycin transferase.
Plasmid pUB-GFP mang gen gfp mã hoá cho protein phát huỳnh quang màu xanh lục (green fluorescent protein); Plasmid p35PAT: mang gen chọn lọc pat mã hoá cho enzym phosphynothrycin transferase, đ−ợc điều khiển bởi đoạn khởi động CaMV35S.
• Chủng Agrobacterium ATHV mang vectơ:
- pBINGUSINT mang gen chỉ thị gus-intron mã hoá cho protein β-glucuronidase và gen chọn lọc nptII mã hoá cho enzym neophosphotransferase. Các trình tự mã hoá cho gen gus và nptII đã đ−ợc thêm đoạn khởi động CaMV35S-P và NOS.
- pBIN4F4 và pBINIIIE9: mang gen chọn lọc nptII mã hoá cho enzym neophosphotransferase và gen 4F4/IIIE9 quy định đặc tính chống chịu lạnh. Các trình tự mã hoá cho gen 4F4/IIIE9 và nptII đã đ−ợc thêm đoạn khởi động NOS và CaMV35S.
- pPLANTA195Zmm4 và pPLANTA195ZAP1 mang gen chọn lọc nptII mã hoá cho enzym neophosphotransferase và gen quy định đặc tính chín sớm Zmm4/IIIE9. Tuy nhiên, hai vectơ chuyển gen này hiện tại ch−a đ−ợc thiết kế hoàn chỉnh.
Chúng tôi sử dụng hệ thống chuyển gen PDS 1100/He (BioRad, USA) để tiến hành các thí nghiệm bắn gen. Các hạt vàng có kích th−ớc 0.6/1um , màng nổ (900- 1800psi), màng dừng, màng mang do hãng BioRad (Đức) cung cấp.
2.3.2. Ph−ơng pháp
2.3.2.1. Ph−ơng pháp thí nghiệm đồng ruộng
Trồng và theo dõi sự sinh tr−ởng, phát triển của các dòng ngô thí nghiệm qua các vụ đông (từ tháng 9 đến tháng 1 năm sau), vụ xuân (từ tháng 2 đến tháng 5) và vụ hè (từ tháng 6 đến tháng 8). Đánh giá các chỉ tiêu nông học của các dòng ngô thí nghiệm theo Tiêu chuẩn trồng trọt 10TCN do Bộ Nông nghiệp & PTNT ban hành.
2.3.2.2. Ph−ơng pháp nuôi cấy mô tế bào
2.3.2.2.1. Ph−ơng pháp tách, nuôi cấy và tái sinh cây từ phôi non
Bắp non sau khi thụ phấn khoảng 18-20 ngày đ−ợc thu để tách phôi trong điều kiện vô trùng. Phôi non đ−ợc cấy trong môi tr−ờng với cách đặt phôi theo mô tả của Green & Phillips (1975) [78].
Tạo mô sẹo, tái sinh cây theo quy trình của Armstrong & Green (1985) [20] có cải tiến.
2.3.2.2.2. Ph−ơng pháp tách, nuôi cấy và tái sinh cây từ bao phấn
Cờ ngô đ−ợc thu vào giai đoạn tiểu bào tử đơn nhân, đ−ợc xử lý lạnh 140C thời gian 7 ngày. Khử trùng và cấy mẫu với mật độ 30 bao phấn/đĩa Petry. Đĩa Petry cùng với bao phấn đ−ợc xử lý lạnh 140C, 7 ngày trong tối sau đó đ−ợc chuyển sang 260C trong tối. Sau 21 ngày kể từ khi cấy, bao phấn đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng tái sinh. Các phôi tạo thành đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng tái sinh mới khi đạt kích th−ớc 2-3 mm.
2.3.2.3. Cải thiện khả năng tái sinh của các dòng ngô Việt Nam bằng ph−ơng pháp di truyền pháp di truyền
Tiến hành lai hữu tính các dòng ngô Việt Nam (VN) có phản ứng thấp trong nuôi cấy phôi non với các dòng ngô nhập nội HR8/HR9 có phản ứng cao trong nuôi cấy phôi non. Tái sinh cây từ phôi non (FN).
Chọn lọc các dòng FN có khả năng tái sinh cao, sinh tr−ởng tốt và lai ng−ợc trở lại với các dòng ngô Việt nam. Tái sinh cây từ phôi non, thu nhận dòng FNBcr1. Tiến hành liên tục các phép lai ng−ợc dòng FNBcr với dòng VN và tái sinh cây, chọn lọc các dòng có khả năng sinh tr−ởng tốt, mang các đặc tính giống dòng VN. Sau 3-5 thế hệ có thể tạo ra dòng ngô Việt nam có phản ứng cao trong nuôi cấy phôi non và thích ứng tốt trong điều kiện Việt Nam (Lê Huy Hàm & CS 1999, 2000)[5], [72].
2.3.2.4. Ph−ơng pháp biến nạp gen
2.3.2.4.1. Ph−ơng pháp biến nạp gen bằng súng bắn gen
• Tách ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli
ADN plasmid đ−ợc tách, tinh sạch theo quy trình của Sambrook & CS, (2001) [91].
• Các phần tử vàng đ−ợc bọc bởi ADN plasmid theo ph−ơng pháp của Sanford & CS, (1993) & Becker & CS, (1994) [93], [23] có cải tiến.
• Tối −u hoá các chỉ tiêu sau: áp suất He, khoảng cách bắn cho từng loại mô sử dụng để chuyển gen, kích th−ớc và hàm l−ợng hạt vàng...
• Tối −u hoá các điều kiện nuôi cấy, chọn lọc cây tái sinh để thu đ−ợc hiệu quả chuyển gen cao
2.3.2.4.2. Ph−ơng pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
• Tối −u hoá các điều kiện nuôi cấy mô tế bào và tái sinh cây,
• Tiến hành lây nhiễm mẫu với vi khuẩn Agrobacterium, diệt khuẩn và chọn dòng mô sẹo và cây tái sinh.
• Tối −u hoá các điều kiện lây nhiễm, tác dụng của các aldehit, nuôi cộng sinh, chọn lọc cây tái sinh để thu đ−ợc hiệu quả chuyển gen cao
2.3.2.5. Ph−ơng pháp đánh giá cây chuyển gen
• Tiến hành sàng lọc cây chuyển gen tái sinh trên môi tr−ờng chứa kháng sinh chọn lọc.
• Sàng lọc cây chuyển gen bằng phản ứng PCR gen chuyển
cây chuyển gen nhận đ−ợc.
• Đánh giá hoạt tính gen chuyển bằng phép thử
• Đ−a cây chuyển gen ra đất trồng, theo dõi khả năng sinh tr−ởng, phát triển, độ hữu thụ và thu hạt thế hệ R1.
2.4. Dạng sản phẩm kết quả tạo ra
• Các dòng ngô có khả năng tái sinh cao, thích hợp cho biến nạp di truyền trong điều kiện Việt Nam.
• Các dòng ngô mang gen chín sớm, gen chịu lạnh, gen tăng c−ờng hấp thụ nitơ
• Quy trình tái sinh cây từ phôi non hiệu quả cao.
• Quy trình tái sinh phôi tạo thành từ nuôi cấy bao phấn.
• Quy trình chuyển gen vào cây ngô thông qua thông qua vi khuẩn
Agrobacterium và súng bắn gen
2.5. Nhu cầu kinh tế, xã hội và địa chỉ áp dụng
• Tạo đ−ợc những quy trình kỹ thuật nền về chuyển gen ở cây trồng, góp phần phát triển lĩnh vực khoa học chọn tạo giống cây trồng bằng công nghệ sinh học.
• Các giống ngô, lúa mỳ ngắn ngày sẽ góp phần tăng c−ờng luân canh xen vụ, qua đó làm tăng diện tích trồng trọt và sản l−ợng. Các giống ngô đ−ợc cải thiện khả năng hấp thụ nitơ cho phép giảm chi phí phân bón, chống ô nhiễm môi tr−ờng. Những giống này đặc biệt thích nghi với các vùng miền núi nơi khả năng đầu t− của ng−ời dân hạn chế. Các giống ngô chịu lạnh đảm bảo an toàn cho vụ ngô đông tại các vùng trồng ngô phía Bắc.
• Đ−a công nghệ tạo cây chuyển gen thành một công cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác chọn tạo giống truyền thống, đồng thời nâng cao năng lực tiếp cận các lĩnh vực khoa học hiện đại trong tạo giống cây trồng.
Ch−ơng 3.
Những nội dung vμ kết quả đ∙ thực hiện
3.1. Xây dựng hệ thống tái sinh
3.1.1. Xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non
3.1.1.1. Cơ sở khoa học và các nghiên cứu về hệ thống tái sinh in vitro
Xây dựng một hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây hoàn chỉnh là tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu biến nạp gen. Sau đây là những hệ thống nuôi cấy th−ờng đ−ợc sử dụng:
• Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc di truyền thấp, ch−a phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền cao. Mô sẹo thu đ−ợc bằng nuôi cấy in vitro các cơ quan của thực vật nh− thân, rễ, lá, hoa... trong môi tr−ờng chứa chất điều hoà sinh tr−ởng nhóm auxin với điều kiện nuôi cấy thích hợp. Mô sẹo có thể đ−ợc duy trì liên tục trên môi tr−ờng nuôi cấy bằng cách cấy chuyển định kì (Lê Trần Bình & CS, 1997 [1]).
3.2. Xây dựng Hệ thống tái sinh
3.2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non
3.2.1.1. Cơ sở khoa học và các nghiên cứu về hệ thống tái sinh in vitro 3.2.1.2. Vật liệu và ph−ơng pháp
3.2.1.3. Hoàn thiện hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây từ phôi non 3.2.1.4. Quy trình tái sinh cây từ phôi non
3.2.1.5. Đánh giá khả năng tái sinh của một số dòng ngô Việt Nam
3.2.2. Xây dựng hệ thống tái sinh phôi từ nuôi cấy bao phấn
3.2.2.1. Đặt vấn đề
3.2.2.2. Vật liệu và ph−ơng pháp.
3.2.2.3. Phản ứng của các giống ngô Việt Nam trong nuôi cấy bao phấn 3.2.2.4. Tối −u hoá quy trình tái sinh phôi từ nuôi cấy bao phấn
3.2.2.5. Quy trình tái sinh cây từ bao phấn
3.2.3. Tạo các dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao bằng ph−ơng pháp di truyền
3.2.3.1. Vật liệu và ph−ơng pháp.
3.2.3.2. Kết quả chọn tạo các dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao 3.1.4. Kết luận
• Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù là kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn hoặc cụm nhỏ tế bào trong môi tr−ờng lỏng. Các tế bào này cũng đ−ợc tạo từ mô sẹo có nguồn gốc từ thân, rễ, lá, hoa, phôi... Tuy nhiên nh−ợc điểm của ph−ơng pháp này là thời gian nuôi cấy dài và ảnh h−ởng trực tiếp tới khả năng tái sinh cây (Dix, 1986 [44]).
• Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc chỉ còn lại khối nguyên sinh chất đ−ợc bao bọc bởi màng nguyên sinh khi đ−ợc nuôi cấy trên môi tr−ờng thích hợp thì tái tạo thành tế bào, phát triển thành khối mô sẹo và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. ứng dụng có ý nghĩa nhất của ph−ơng pháp này là tạo cây soma, tạo cây lai tế bào chất thông qua dung hợp tế bào trần và biến nạp gen.
Nhằm mục đích xây dựng một hệ thống nuôi cấy tái sinh cây phục vụ chuyển gen chúng ta cần nghiên cứu đến khả năng sống sót của tế bào sau khi chuyển gen trên môi tr−ờng chọn lọc. Do vậy hệ thống nuôi cấy huyền phù th−ờng hiếm khi đ−ợc sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen, đặc biệt chuyển gen nhờ vi khuẩn
Agrobacterium. Trong khi đó, hệ thống nuôi cấy qua mô sẹo lại rất thích hợp với một số −u điểm nh− có tỉ lệ tái sinh cây cao, thời gian nuôi cấy không quá dài, thao tác nuôi cấy đơn giản. Tái sinh cây qua con đ−ờng mô sẹo có thể hình thành phôi hay tái sinh tạo chồi trực tiếp. Tuy nhiên, cây tái sinh từ phôi soma xuất phát từ một tế bào đơn, riêng lẻ và phát triển thành một cây hoàn chỉnh nên duy trì đ−ợc tính đồng nhất của hệ gen và do vậy hạn chế hiện t−ợng khảm ở cây chuyển gen (Lê Trần Bình & CS, 1997 [1]).
Lần đầu tiên cây ngô in vitro đã đ−ợc Green và Philips (1975) [58] tái sinh từ các mẫu phôi non. Tiếp theo đó có nhiều nghiên cứu thành công về tái sinh cây ngô từ các nguồn vật liệu khác nhau nh− bao phấn (Ting & CS, 1981) [104], phôi non (Lu & CS, 1982; Lu và Vasil, 1983; Vasil & CS, 1984) [75] [74] [112], tế bào mày ngô (Suprasanna & CS, 1986) [102], hoa non (Pareddy và Petolino, 1990) [82], cờ non (Rhodes & CS, 1986; Songstad & CS, 1992) [87], [99], mẩu lá (Conger & CS, 1987; Ray và Gosh, 1990) [41], [86], đoạn thân cây con (Santos & CS, 1984) [94],
chồi đỉnh (O’Connor-Sánchez & CS, 2002; Zhong & CS, 1992) [80], [120] và mô phân sinh chồi đỉnh (Sairam & CS, 2003; Zhang & CS, 2002) [90], [119].
Nhìn chung, hệ thống tái sinh cây đạt hiệu quả cao hơn cả là tái sinh thông qua mô sẹo tạo thành từ phôi non. Phôi non đ−ợc sử dụng làm nguồn vật liệu chính trong các nghiên cứu nuôi cấy mô ở ngô (Lu & CS, 1982; Lu và Vasil, 1983; Vasil & CS, 1984) [75], [74], [112], nh−ng việc thu nhận th−ờng xuyên vật liệu phôi non gặp nhiều khó khăn và việc có đ−ợc phôi non ở giai đoạn thích hợp cho nuôi cấy cũng bị hạn chế (Huang & Wei, 2004) [66]. Để có đ−ợc hiệu quả tái sinh cao thì cần phải nghiên cứu sự phát sinh hình thái của phôi non trong điều kiện in vitro và các yếu tố ảnh h−ởng đến sự phát triển của phôi.
Sự phát triển của phôi ngô non trong điều kiện in vitro
Matthys-Rochon & CS (1998) [77] khi nghiên cứu sự phát triển in vitro của phôi ngô non từ các tế bào tiền phôi cho thấy thời gian để các tế bào này phát triển thành phôi ở giai đoạn 1-2 dài hơn so với ở cây từ 1-2 ngày và cần khoảng 2 tháng để phát triển thành cây tr−ởng thành. Và cũng cần l−u ý rằng mùa vụ cũng ảnh h−ởng đến sự phát triển của các tế bào tiền phôi. Từ tháng 5 đến tháng 9, khả năng phát triển của chúng đã tăng một cách đáng kể. Loại đ−ờng sử dụng trong môi tr−ờng nuôi cấy cũng có ảnh h−ởng đến sự phát triển của phôi. Đ−ờng sucrose sẽ đ−ợc biến đổi thành glucose và fructose. Fructose đ−ợc xem nh− là một nguồn cacbon không có hiệu quả (Vasil, 1984) [112] do vậy có thể các tế bào phôi hoá sẽ sử dụng glucose tr−ớc sau đó mới sử dụng fructose. Maltose sẽ đ−ợc biến đổi thành hai phân tử đ−ờng glucose, do vậy loại đ−ờng này sẽ là nguồn dinh d−ỡng có hiệu quả hơn đối với phôi. Nhận xét này cũng t−ơng tự với kết luận của một số tác giả khi nghiên cứu vai trò kích thích của đ−ờng maltose trong quá trình nuôi cấy các tế bào sinh dục của các cây ngũ cốc.
Việc xác định đúng vị trí đặt phôi trên môi tr−ờng nuôi cấy là rất cần thiết đối với sự sinh tr−ởng bình th−ờng của phôi. Trong tự nhiên, tế bào scutellum tiếp xúc trực tiếp với nguồn dinh d−ỡng: nội nhũ. Việc tiếp xúc trực tiếp của các tế bào
scutellum với lớp tế bào d−ới sẽ dẫn tới việc cung cấp đầy đủ dinh d−ỡng từ môi tr−ờng cho phôi.
Một yếu tố quan trọng cuối cùng đó là ảnh h−ởng của kiểu gen lên sự phát triển của phôi. A188 đ−ợc xem nh− là kiểu gen thích hợp cho nuôi cấy in vitro
(Armstrong và Green, 1985) [20].
Để tránh sử dụng phôi non, Zhong & CS (1992) [120] đã tạo cụm chồi thành công với tần số cao từ chồi đỉnh của các cây con nảy mầm từ hạt trong điều kiện in vitro. 36 dòng ngô khác nhau đã đ−ợc thí nghiệm bằng ph−ơng pháp này và tần số tái sinh dao động từ 24% đến 97%. Hệ thống tái sinh cây từ chồi đỉnh này cũng đã đ−ợc áp dụng thành công trong các nghiên cứu cải thiện di truyền ở ngô. Zhong & CS (1996) [18] đã tái sinh hiệu quả các cây ngô chuyển gen bằng ph−ơng pháp bắn gen sử dụng chồi đỉnh. Cũng t−ơng tự, O’Connor-Sánchez & CS (2002) [80] đã nhận đ−ợc các cây chuyển gen của các dòng ngô nhiệt đới và cận nhiệt đới bằng cách bắn gen vào các mô sẹo đã biệt hoá và các mô sẹo phôi hoá tạo thành từ chồi đỉnh. Zhang & CS (2002) [119] cũng đã chuyển gen vào các tế bào mô phân sinh chồi nhận đ−ợc từ các cây con nảy mầm từ hạt của các dòng ngô thuần bằng ph−ơng pháp bắn gen. Sairam & CS (2003) [90] cũng đã thu đ−ợc các cây ngô chuyển gen bằng cách lây nhiễm trực tiếp mô phân sinh chồi đỉnh với các chủng vi khuẩn
Agrobacterium mang vectơ chứa gen gfp.
Các nghiên cứu tái sinh cây thông qua mô sẹo tạo thành từ phôi tr−ởng thành