Phổ vật chủ của Agrobacterium đã đ−ợc xác định là rất rộng, song hiệu quả biến nạp gen lại không giống nhau ở các cây chủ khác nhau. ở cây hai lá mầm có tần suất chuyển nạp gen cao hơn nhiều so với cây một lá mầm (Briew, 2000) [29]. Một b−ớc đột phá trong lĩnh vực này đã có đ−ợc ở cây lúa với những bằng chứng về di truyền phân tử của các cây chuyển gen. Các phân tích ở mức độ phân tử cho thấy sự kết hợp của T-ADN trong genome của cây một lá mầm về cơ bản cũng t−ơng tự nh− ở các cây hai lá mầm (Hiei & CS, 1994) [64].
Ngày nay ng−ời ta đã tìm ra các chủng Agrobacterium mẫn cảm với cây một lá mầm trong đó có ngô, lúa và đã nhận đ−ợc các cây chuyển gen hữu thụ bằng ph−ơng pháp này (Hooykaas-Van Slogteren & CS, 1984; Graves & Goldmen, 1986; Grimsley & CS, 1987; Schafer & CS, 1987; Hiei & CS, 1994; Ishida & CS, 1996) [65] [57] [60] [95] [64] [67]. Nghiên cứu của Graves & Goldman (1986) [57] cho thấy các tế bào phôi và tế bào lá mầm của hạt ngô nảy mầm đã đ−ợc lây nhiễm với
Agrobacterium để tạo ra các cây chuyển gen. Điều này đã thúc đẩy các nghiên cứu tiếp theo trong chuyển gen ở các cây ngũ cốc nh− lúa mỳ (Cheng & CS, 1997) [35], lúa mạch (Tingay & CS, 1997) và đặc biệt là ở ngô: Ishida & CS (1996) và Frame & CS, 2002) [67] [51] đã nhận đ−ợc cây ngô chuyển gen bằng các nghiên cứu biến nạp vào phôi non thông qua Agrobacterium.
Một hệ thống chuyển gen thông qua Agrobacterium hiệu quả đòi hỏi có tần số chuyển T-ADN vào tế bào thực vật cao cùng với khả năng tái sinh tốt (Hiei & CS, 1997; Graves & Goldman, 1986) [64] [57]. Cần l−u ý rằng một vài tế bào mô mặc dù có khả năng phân bào cao nh−ng lại có khả năng tái sinh kém; do vậy chúng không thể là nguồn vật liệu tốt cho chuyển gen (Hiei & CS, 1997; Graves & Goldman, 1986) [64], [57]. Việc sử dụng các tế bào có khả năng tái sinh cao, đặc biệt nh− phôi non hay mô sẹo phôi hoá nhận đ−ợc từ phôi non, hiện đang là các mô lý t−ởng cho việc tái sinh ở các cây một lá mầm, đóng vai trò quan trọng trong sự thành công của quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium (Chan & CS, 1993; Hiei & CS, 1994; Zhang & CS, 1997; Rashid & CS, 1996; Aldemita & Hodges 1996; Cheng &CS, 2004) [34], [64], [118], [85], [19], [36].
Hai yếu tố cần thiết để chuyển gen thành công thông qua Agrobacterium: Thứ nhất là sự biểu hiện của các gen vir, đ−ợc kích thích bởi số l−ợng đủ các hợp chất phenol nh− acetosyringon, đ−ợc giải phóng ra từ các tế bào thực vật bị tổn th−ơng và thứ hai là, khả năng phân chia của các tế bào thực vật đã đ−ợc lây nhiễm tại vùng bị tổn th−ơng. Phản ứng tổn th−ơng của cây một lá mầm rất khác so với cây hai lá mầm: chúng th−ờng có xu h−ớng bị hoá gỗ và không có sự phân chia của các tế bào. Đây là một trong những nguyên nhân chính gây cản trở cho việc lây nhiễm các cây một lá mầm với Agrobacterium (Hiei & CS, 1997) [64]. Hiệu quả biến nạp gen phụ thuộc vào một số yếu tố nh−: chủng Agrobacterium, cấu trúc vectơ chuyển gen, kiểu gen thực vật, các tiền xử lý mô thực vật, nguồn vật liệu gây nhiễm, nồng độ vi khuẩn, thời gian nuôi nhiễm, thành phần môi tr−ờng nuôi cấy, nhiệt độ ...và đặc biệt là khả năng tái sinh của thực vật sau biến nạp. Một số yếu tố ảnh h−ởng tới hiệu quả chuyển gen cũng đã đ−ợc nghiên cứu (Kaeppler & CS, 2001) [71].
Chuyển gen vào tế bào thực vật kết hợp hai ph−ơng pháp dùng súng bắn gen và Agrobacterium nhằm sử dụng các −u điểm của mỗi ph−ơng pháp, nâng cao hiệu quả chuyển gen đã đ−ợc nghiên cứu tr−ớc đây ở cây thuốc lá, hoa h−ớng d−ơng (Bidney & CS, 1992) [25], cây chuối (May & CS, 1995) [78] và các cây họ đậu (Droste & CS, 2000) [46]. Các giống ngô nhiệt đới chuyển gen cũng đã nhận đ−ợc bằng việc kết hợp hai ph−ơng pháp này (Vasconcelos & CS, 1998) [109]. Tế bào thực vật tr−ớc khi lây nhiễm với Agrobacterium đ−ợc làm tổn th−ơng bằng cách “bắn” đạn không mang gen. Ph−ơng pháp này có thể cho hiệu quả chuyển gen cao, bởi sau khi bị “bắn” mô tạo phản ứng đối với vết th−ơng, kích thích cho lây nhiễm bằng Agrobacterium (Droste & CS, 2000) [46].
3.2.2.2. Vật liệu và ph−ơng pháp 3.2.2.2.1. Vật liệu
Vật liệu thực vật
Vật liệu sử dụng trong các thí nghiệm là phôi đ−ợc tách từ bắp non của dòng ngô nhập nội HR8 (do Viện Công nghệ liên bang ETH, Thuỵ sỹ cung cấp). Các cây ngô mẹ cho bắp thí nghiệm đ−ợc trồng trong nhà l−ới.
Vi khuẩn Agrobacterium và plasmid vector
Vectơ pBINGUSINT và pSB11-PAT-ubi-GUSINT đ−ợc đ−a vào các chủng vi khuẩn Agrobacterium ATHV, LBA 4404 và AGL1 để lây nhiễm với phôi non dòng ngô HR8. Vectơ pBINGUSINT mang gen chỉ thị gus-intron mã hoá cho protein β- glucuronidase và gen chọn lọc nptII mã hoá cho enzym neophosphotransferase. Các trình tự mã hoá cho gen gus và nptII đã đ−ợc thêm đoạn khởi động CaMV35S và
nos. Vector pSB11-PAT-ubi-GUSINT mang gen chỉ thị gus-intron đ−ợc điều khiển bởi đoạn khởi động ubiquitin và gen chọn lọc P35S-pat (hình 17).
Các vectơ và chủng Agrobacterium do Công ty KWS/PLANTA (CHLB Đức) thiết kế và cung cấp.
3.2.2.2.2. Ph−ơng pháp
Phôi dòng HR8 đ−ợc tách từ các bắp ngô non ở giai đoạn 1 có kích th−ớc từ 1-2mm (ở độ tuổi 18 – 20 ngày sau thụ phấn). Phôi non sau khi tách đ−ợc lây nhiễm và nuôi cấy cộng sinh với vi khuẩn A. tumefaciens theo quy trình của Frame & CS (2002) [51] có cải tiến.
a) Các môi tr−ờng nuôi cấy và biến nạp:
Hình 17. Sơ đồ cấu trúc vectơ pBINGUSINT vμ pSB11-PAT-ubi-GUSINT sử dụng cho các nghiên cứu biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
- Môi tr−ờng nuôi vi khuẩn (LB) - Môi tr−ờng lây nhiễm (IM)
- Môi tr−ờng đồng nuôi cấy (CCM) - Môi tr−ờng nuôi phục hồi (ReM) - Môi tr−ờng tạo mô sẹo phôi hoá (ECM) - Môi tr−ờng tái sinh chồi (SeM)
- Môi tr−ờng tạo cây hoàn chỉnh (RM)
Thành phần của các môi tr−ờng đ−ợc giới thiệu ở bảng 23.
Bảng 23. Thμnh phần môi tr−ờng nuôi cấy vμ chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium ở ngô
Thành phần IM CCM ReM ECM SeM RM
N6* + + + + + MS* + Sucrose g/l 30 30 30 30 30 30 Glucose g/l 60 L-proline (g/l) 0.7g 0.7g 0.7g 0.7g MES (g/l) 0.5g 0.5g 0.5g 2,4-D (mg/l) 2 mg 2 mg 1 mg pH 5.2 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 AgNO3 (1mg/ml) 1 10 10 AS (100mM/ml) 2ml 2ml Cefotaxime (100mg/ml) 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml Myo-inositol (g/l) 1 Paromomycine (50mg/ml) 2ml 2ml 2 ml
MS*: Thành phần muối khoáng và vitamin theo Murashige & Skoog (Murashige & CS, 1962) [79] N6*: Thành phần muối khoáng và vitamin theo Chu & CS (1975) [40]
b) Chuyển gen thông qua Agrobacterium
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn
Cấy trải Agrobacterium cất giữ trong glyxerol lên đĩa môi tr−ờng LB thạch có bổ sung rifampicin 100mg/l và kanamycin 50 mg/l, nuôi ở 210C trong 2-3 ngày. Sau đó lấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong môi tr−ờng LB lỏng có bổ sung 50mg/L
kanamycin và lắc ở 160 vòng/phút, 280C. Sau 8-12 giờ lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy trên ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, ở 40C trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn vi khuẩn với môi tr−ờng IM và pha loãng cho tới OD600 ≈ 0.5-1.0. Dịch huyền phù vi khuẩn này đ−ợc sử dụng để lây nhiễm ngay với phôi ngô non.
Lây nhiễm vi khuẩn với phôi non
Bắp non đ−ợc thu từ các cây ngô mẹ trồng trong nhà l−ới hoặc ngoài ruộng. Ngay sau khi thu, phôi non đ−ợc tách trong điều kiện vô trùng. Phôi non sau đó đ−ợc đặt trên giấy lọc (đã vô trùng) ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn khoảng 30-60 phút, lắc nhẹ ở nhiệt độ 250C. Sau đó phôi đ−ợc chuyển sang môi tr−ờng đồng nuôi cấy CCM, nuôi trong tối 4 ngày, ở nhiệt độ 210C.
c) Đánh giá biểu hiện tạm thời của gen gus
Tiến hành đánh giá biểu hiện tạm thời của gen gus ở mô thực vật sau khi biến nạp theo ph−ơng pháp nhuộm tế bào học của Jefferson (Jefferson & CS, 1987 [70] nh− sau: Phôi non sau 4 ngày nuôi cộng sinh đ−ợc nhuộm với dung dịch X-Gluc, để 8-12 giờ trong tối ở 370C. Quan sát biểu hiện của gen gus bằng sự xuất hiện các đốm xanh chàm trên phần scutellar của phôi lây nhiễm.
Tần số biểu hiện gen tạm thời đ−ợc tính bằng số phôi có đốm xanh chàm xuất hiện trên phần tế bào scutellar của phôi lây nhiễm trên tổng số phôi nhuộm X- Gluc.
3.2.2.3. Hoàn thiện quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium
3.2.2.3.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn Agrobacterium và vector thích hợp cho biến nạp gen ở ngô
Các loài cây một lá mầm không phải là vật chủ tự nhiên của Agrobacterium. Nh−ng cho tới nay ng−ời ta đã tìm ra một số chủng Agrobacterium mẫn cảm với cây một lá mầm trong đó có ngô, lúa (Ishida & CS, 1996; Frame & CS, 2002) [67], [51].
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm phôi non dòng ngô HR8 với 3 chủng vi khuẩn Agrobacterium ATHV, LBA4404 và AGL1 mang vector hai nguồn pBINGUSINT và pSB11-PAT-ubi-GUSINT với mục đích lựa
chọn chủng vi khuẩn và vector thích hợp cho biến nạp gen ở ngô. Kết quả thu đ−ợc trình bày ở bảng 24.
Xét về ảnh h−ởng của chủng Agrobacterium đến hiệu quả chuyển gen: trong số 3 chủng Agrobacterium mang vector hai nguồn pBINGUSINT thì chủng ATHV xâm nhiễm có hiệu quả nhất vào phôi ngô non dòng HR8, tần số biểu hiện gen tạm thời đạt đ−ợc t−ơng đối cao (49%). Mức độ xâm nhiễm kém hơn đã quan sát thấy ở chủng AGL1 (29.1%) và kém nhất ở chủng LBA4404 (10.9%).
Xét về ảnh h−ởng của cấu trúc vectơ đến biểu hiện gen tạm thời: kết quả ở bảng 18 cho thấy khi sử dụng vectơ pSB11-PAT-ubi-GUSINT tần số biểu hiện gen tạm thời thu đ−ợc thấp hơn nhiều so với vectơ pBINGUSINT ở cả 3 chủng
Agrobacterium, dao động từ 2.8-21.3%. Mức độ xâm nhiễm kém nhất cũng quan sát thấy ở chủng LBA4404 (2.8%) (hình 18).
Bảng 24. Biểu hiện tạm thời của gen gus khi biến nạp các chủng Agrobacterium vμ
vector khác nhau vμo phôI non dòng ngô HR8 Số phôi non Chủng Agrobacterium/vector Lây nhiễm Nhuộm GUS Có đốm xanh Tần số biểu hiện gen tạm thời (%)
ATHV(pBIN GUS INT) 264 193 95 49.0
LBA4404(pBIN GUS INT) 302 256 28 10.9
AGL1(pBIN GUS INT) 360 299 87 29.1
ATHV(pSB11-PAT-ubi-GUSINT) 208 185 34 18.3
LBA4404(pSB11-PAT-ubi-GUSINT) 279 210 6 2.8
AGL1(pSB11-PAT-ubi-GUSINT) 249 234 50 21.3
Các nghiên cứu tr−ớc đây đã đ−a ra một số chủng Agrobacterium có khả năng xâm nhiễm hiệu quả vào phôi non của các dòng ngô khác nhau: Frame & CS (2002) [51] đã thành công khi biến nạp chủng EHA101 mang vectơ hai nguồn pTF102 với phôi non dòng ngô lai HiII; Lupotto & CS (1999) [76] đã lây nhiễm chủng EHA101 mang vector pMTCA23GUSINT với phôi non dòng ngô B73; Ishida & CS, (1996) [67] cũng đã thu đ−ợc cây chuyển gen tái sinh khi biến nạp chủng LBA4404 mang vectơ pSB131 vào phôi non dòng ngô A188. Nh−ng cho tới nay
hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium ở các cây một lá mầm nói chung, và đặc biệt là ở ngô còn t−ơng đối thấp, ng−ời ta vẫn ch−a tìm ra đ−ợc một chủng hay một vectơ nào thích hợp có thể sử dụng để biến nạp vào tất cả các dòng/giống ngô. Điều này phản ánh tính phức tạp trong mối t−ơng tác giữa Agrobacterium và thực vật. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã lựa chọn đ−ợc chủng ATHV mang vector pBINGUSINT để lây nhiễm với dòng ngô HR8 cho hiệu quả biến nạp gen tạm thời t−ơng đối cao.
3.2.2.3.2. ảnh h−ởng của kích th−ớc phôi nuôi cấy đến mức độ xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium
Một trong những yếu tố cần thiết để chuyển gen thành công thông qua vi khuẩn Agrobacterium là khả năng phân chia của các tế bào thực vật đã đ−ợc lây nhiễm tại vùng bị tổn th−ơng. Phản ứng tổn th−ơng của cây một lá mầm rất khác so
ATHVpBIN GUS INT
ATHVpBIN GUS INT
A
ATHVpBIN GUS INT
ATHVpBIN GUS INT
A
AGL1pBIN GUS INT AGL1pBIN GUS INT
LBA4404pBIN GUS INT
LBA4404pBIN GUS INT
LBA4404pBIN GUS INT
LBA4404pBIN GUS INT LBA4404pSB111LBA4404pSB111LBA4404pSB111LBA4404pSB111----PATPATPATPAT----ubiubiubiubi----GUSINTGUSINTGUSINTGUSINT
Hình 18. Biêủ hiện tạm thời của gen gus ở phôi non dòng HR8 biến nạp với các chủng Agrobacterium mang các vector khác nhau
với cây hai lá mầm: chúng th−ờng có xu h−ớng bị hoá gỗ và không có sự phân chia của các tế bào. Đây là một trong những nguyên nhân chính gây cản trở cho việc lây nhiễm các cây một lá mầm với Agrobacterium (Hiei & CS, 1997) [64]. Ngoài ra, khả năng tái sinh của phôi non còn phụ thuộc vào kích th−ớc của phôi nuôi cấy (Todorova & CS, 1998 ; Phạm Thị Lý Thu & CS, 2003) [106], [15]. Mục đích của nghiên cứu này là xác định giai đoạn phát triển thích hợp của phôi non sao cho sự xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium đạt hiệu quả nhất.
Phôi non đ−ợc tách từ các bắp non dòng ngô HR8 ở độ tuổi từ 14-22 ngày sau thụ phấn (t−ơng ứng với phôi có kích th−ớc 0,5 mm đến 3 mm). Chủng vi khuẩn
Agrobacterium ATHVpBINGUSINT đ−ợc sử dụng để lây nhiễm. Quan sát về hình thái của phôi non dòng HR8 cho thấy, các phôi ở độ tuổi 14 ngày sau thụ phấn có kích th−ớc rất nhỏ (< 0,5mm), trong suốt, rất khó quan sát thấy bằng mắt th−ờng. Phôi non có màu trắng đục đến màu vàng nhạt là các phôi ở độ tuổi từ 16-22 ngày sau thụ phấn và có kích th−ớc t−ơng ứng 0,5 đến 3mm.
Bảng 25. T−ơng tác giữa kích th−ớc phôi nuôi cấy vμ mức độ xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium trong biến nạp gen ở ngô
Kích th−ớc (mm) - Tuổi phôi (ngày
STP) Số phôi lây nhiễm Số phôi nhuộm GUS Số phôi có đốm xanh Tần số biểu hiện gen tạm thời (%)
Mức độ biểu hiện gen
gus và vị trí của các đốm xanh <0.5 (14) 192 192 79 41.1 0.5 (16) 126 118 58 49.1 Nhiều đốm xanh rất đậm, tập trung thành đám ở mép phôi 0.5-1 (18) 250 168 70 41.6 Các đốm xanh rất đậm, riêng rẽ ở mép phôi 1-1.5 (20) 186 186 134 72.0 Nhiều đốm xanh đậm, tập trung ở phần scutellum 20-22 (2-3) 304 304 83 27.3 Một vài đốm xanh nhạt ở phần scutellum
Kết quả thu đ−ợc ở bảng 25 cho thấy tần số chuyển gen tạm thời đạt giá trị cao nhất (72%) ở những phôi có kích th−ớc từ 1-1.5mm (phôi ở độ tuổi 20 ngày sau thụ phấn). Trong tr−ờng hợp phôi có kích th−ớc nhỏ hơn 0.5mm, hoạt tính gen gus
thấp ở phôi non sau thụ phấn 20-22 ngày (có kích th−ớc lớn hơn 2mm) (chỉ đạt 27.3%).
Xét về hoạt tính gen gus và sự phân bố của các đốm xanh, kết quả thí nghiệm của chúng tôi cho thấy hầu hết các đốm xanh đậm tập trung thành từng đám ở phần mép của các phôi có kích th−ớc nhỏ (d−ới 0.5mm). Mật độ đốm xanh cũng nh− mức độ biểu hiện của gen gus thu đ−ợc thấp hơn ở những phôi có kích th−ớc 1-1.5mm (hình 19).
Tuy nhiên, với những phôi có kích th−ớc lớn (trên 2mm) chúng tôi chỉ quan sát thấy một vài đốm xanh rất nhạt và số phôi có đốm xanh rất ít, tần số biểu hiện gen tạm thời đạt đ−ợc rất thấp. Các nghiên cứu tr−ớc đây của chúng tôi về xây dựng hệ thống tái sinh cây từ phôi non cũng cho thấy với những phôi có kích th−ớc nhỏ (d−ới 1mm) thì khả năng tái sinh cây rất thấp (Phạm Thị Lý Thu & CS, 2003) [15]. Vì thế, kết hợp giữa khả năng tái sinh cây và hoạt tính gen gus, phôi hợp tử non có
0.5-1mm
1-1.5mm 2-3mm
Hình 19. Biểu hiện tạm thời của gen gus ở các phôi non có kích th−ớc khác nhau sau khi biến nạp với chủng ATHV(pBINGUSINT)
kích th−ớc 1-1.5mm là thích hợp để lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium. Nghiên cứu của Lupotto (1999) [76] và Ishida(1996) [67] cũng có những nhận xét t−ơng tự.
3.2.2.3.3. ảnh h−ởng của loại mô lây nhiễm đến hiệu quả biến nạp gen
Trong quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium khả năng mẫn cảm của mô thực vật đối với sự xâm nhiễm của vi khuẩn rất đặc tr−ng, phụ thuộc nhiều vào giai đoạn phát triển và dạng mô lây nhiễm. Đối với cây ngô, các dạng mẫu mô khác nhau đã đ−ợc sử dụng để lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium: chồi đỉnh tách từ cây con 3 ngày tuổi (Gould & CS, 1991) [56]; đoạn thân mầm cắt từ phôi tr−ởng thành (Grimsley & CS, 1987) [60]; và phôi non kích th−ớc 1-1.2mm (Lupotto & CS, 1999) [76]. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã thành công khi sử dụng phôi non để lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium.
Trong nghiên cứu này các dạng mô khác nhau đã đ−ợc thử lây nhiễm với
Agrobacterium (phôi non, mô sẹo tạo thành từ phôi non): phôi non (20 ngày sau thụ phấn) sau khi tách đ−ợc nuôi cấy trên môi tr−ờng tạo mô sẹo với các khoảng thời gian khác nhau từ 0, 4, 8 đến 12 ngày. Chủng vi khuẩn ATHV (pBINGUSINT) đ−ợc