3.1.2.1. Đặt vấn đề
Bên cạnh hệ thống tái sinh cây từ phôi non, tái sinh cây từ tế bào và mô đơn bội có thể là mô hình lý t−ởng cho các nghiên cứu chuyển gen. Các mô này sau khi đ−ợc biến nạp và l−ỡng bội hoá sẽ có thể bỏ qua quá trình chọn lọc để đ−a về dạng đồng hợp tử, các gen mới biến nạp có thể đ−ợc biểu hiện ở ngay thế hệ đầu.
Một quy trình nuôi cấy bao phấn về cơ bản có thể chia làm ba giai đoạn:
1. Giai đoạn tạo các cấu trúc phôi (Embryo - Like- Structures) từ các hạt phấn nuôi cấy. Các cấu trúc phôi này sau đó có khả năng phân chia tế bào và biệt hoá cơ quan hình thành cây hoàn chỉnh trong những điều kiện thích hợp.
22,5 3,4 3,4 10,0 5,2 6,2 8,7 10,5 13,7 1,4 13,3 0 5 10 15 20 25 Tỉ lệ tái s inh c â y ( % ) HR8 GA GB G35 G2 G3 G5 GC2 GC8 GS3 GX2 Dòng
2. Giai đoạn biệt hoá cơ quan và tái sinh cây đơn bội từ các cấu trúc phôi (giai đoạn tái sinh).
3. Giai đoạn l−ỡng bội hoá bộ nhiễm sắc thể của các cây đơn bội tạo thành cây đơn bội kép (doubled haploids) đồng hợp tử cùng nguồn gen.
Các ph−ơng pháp nhằm giảm tỷ lệ chết của các hạt phấn th−ờng góp phần nâng cao tần số tạo cấu trúc phôi. Thông th−ờng thì một hạt phấn đơn lẻ sẽ hình thành một cấu trúc phôi nh−ng cũng có tr−ờng hợp một hạt phấn hình thành nhiều cấu trúc phôi.
Trong thời gian vừa qua, mặc dù đã có nhiều thành tựu trong lĩnh vực nghiên cứu đơn bội ở ngô nh−ng việc đ−a kỹ thuật này vào ứng dụng rộng rãi cho chọn giống và nghiên cứu vẫn còn các khó khăn chính sau đây cần phải khắc phục:
• Tính phụ thuộc vào giống: Một số giống ngô có phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn, nh−ng đại đa số các giống có phản ứng thấp hoặc không phản ứng.
• Tần số tái sinh cây từ phôi tạo thành trong nuôi cấy bao phấn còn thấp (3 - 5%). Vì vậy, các nghiên cứu của chúng tôi sẽ tập trung vào việc cải tiến môi tr−ờng cũng nh− điều kiện nuôi cấy nhằm hoàn thiện quy trình tái sinh cây, với mục đích sử dụng làm hệ thống nuôi cấy cho các nghiên cứu biến nạp gen ở ngô.
3.1.2.2. Vật liệu và ph−ơng pháp
Vật liệu
Với mục đích xây dựng và lựa chọn hệ thống tái sinh thích hợp cho các nghiên cứu biến nạp gen ở ngô, chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm nuôi cấy bao phấn với các dòng ngô đã sử dụng cho các nghiên cứu tái sinh từ phôi non nh− sau:
• 10 dòng ngô Việt Nam: GA, GB, G35, G2, G3, G5, GC2, GC8, GS3, GX2, đ−ợc chọn lọc từ tập đoàn ngô của Viện Di truyền nông nghiệp.
• Dòng ngô nhập nội M24 là dòng có phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn đ−ợc chúng tôi sử dụng cho các nghiên cứu tối −u hoá quy trình nuôi cấy.
Ph−ơng pháp
Thu mẫu:
Các cây cho bao phấn đ−ợc trồng trong v−ờn thực nghiệm, Viện Di truyền nông nghiệp. Các cờ ngô đ−ợc hái khi phần lớn các hạt phấn của tiểu bào tử ở giai
đoạn đơn nhân giữa hoặc giai đoạn đầu hai nhân. Các giai đoạn này của tiểu bào tử có liên quan với các đặc điểm hình thái bên ngoài nh− kiểu của hoa đực, mức độ nhô lên, màu sắc bao phấn v.v... vì thế có thể căn cứ vào các đặc điểm này mà xác định giai đoạn của các tiểu bào tử. Hoa đực sau khi lấy khỏi cây đ−ợc xử lý lạnh ở 14oC trong vòng 7 - 10 ngày. Sau khi xử lý lạnh các hoa đực đ−ợc phân loại d−ới kính hiển vi để lựa chọn những phân đoạn cành chứa các tiểu bào tử ở giai đoạn cần thiết, đ−ợc khử trùng bằng Hypoclorit Natri (1%) trong vòng 15 phút. Sau đó bao phấn đ−ợc sắp xếp ngẫu nhiên trên môi tr−ờng với mật độ 24 – 30 bao phấn/đĩa.
Môi tr−ờng nuôi cấy (Phụ lục 1, bảng 1.2.)
• Môi tr−ờng tạo cấu trúc phôi (IM)
Môi tr−ờng tạo cấu trúc phôi cơ bản có các khoáng đa l−ợng và vi l−ợng theo công thức của môi tr−ờng Yu-pei (YP) (Ku & CS, 1978) đ−ợc cải tiến bằng việc bổ sung thành phần các chất hữu cơ theo môi tr−ờng tạo cấu trúc phôi của Genovesi và Collins (1982). Tuỳ theo từng thí nghiệm và ph−ơng thức thí nghiệm, các thành phần môi tr−ờng IM đ−ợc thay đổi khác nhau nhằm tìm hiểu ảnh h−ởng của chúng lên tần số phản ứng nuôi cấy của các bao phấn ngô. Hai trạng thái môi tr−ờng đ−ợc sử dụng: môi tr−ờng đặc và môi tr−ờng lỏng.
• Môi tr−ờng tái sinh cây (SM)
Môi tr−ờng tái sinh cây có các thành phần khoáng vi l−ợng và đa l−ợng theo công thức môi tr−ờng YP bổ sung 1mg/l Kinetin. Môi tr−ờng có chất tạo giá thể phytagel (3,0g/l) và saccaro (30g/l).
• Môi tr−ờng nhân nhanh chồi (SMM)
Có thành phần khoáng vi l−ợng, đa l−ợng MS (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung 2mg/l BAP, agar 5,5g/l và 30g/l saccaro
• Môi tr−ờng tạo rễ (RM)
Có thành phần khoáng vi l−ợng, đa l−ợng MS (Murashige & Skoog, 1962)bổ sung 5mg/l IAA (hoặc 5mg/l NAA), agar 5,5g/l và 30g/l saccaro.
Các chỉ tiêu theo dõi
Số cấu trúc phôi hình thành Khả năng tạo cấu trúc phôi =
Số cây tái sinh Khả năng tái sinh cây =
100 cấu trúc phôi hình thành
3.1.2.3. Phản ứng của các giống ngô Việt Nam trong nuôi cấy bao phấn
Bao phấn đ−ợc thu từ 10 dòng ngô Việt Nam: GA, GB, G35, G2, G3, G5, GC2, GC8, GS3, GX2 và nuôi cấy trên môi tr−ờng tạo cấu trúc phôi IM có bổ sung 90g/l saccaro và 5g/l than hoạt tính. Sau 21 ngày bao phấn đ−ợc chuyển sang môi tr−ờng tái sinh RM. Phản ứng của các dòng ngô Việt Nam trong nuôi cấy bao phấn đ−ợc trình bày trong bảng 9.
Bảng 9. Phản ứng của các giống ngô Việt Nam trong nuôi cấy bao phấn. TT Dòng Số bao phấn cấy Số phôi thu đ−ợc Tỷ lệ tạo phôi (%)
1 GA 369 12 3.3 2 GB 472 8 1.7 3 G35 348 7 2.0 4 G2 299 25 8.4 5 G3 301 20 6.6 6 G5 312 9 2.9 7 GC2 326 0 0.0 8 GC8 504 58 11.5 9 GS3 295 0 0.0 10 GX2 402 0 0.0
Kết quả thí nghiệm đ−ợc trình bày ở bảng 9 cho thấy: Trong số m−ời giống ngô Việt Nam đ−a vào thí nghiệm có 7 giống cho phản ứng trong nuôi cấy bao phấn, 3 giống không cho phản ứng. Mức độ phản ứng của các giống ngô Việt Nam nhìn chung là thấp (từ 0-11,5%); 2 giống phản ứng từ 1,1 - 2%; 2 giống phản ứng từ 2,1 - 4%; và 3 giống cho phản ứng lớn hơn 5% là G2, G3, GC8. Dòng GC8 có mức phản ứng nuôi cấy bao phấn t−ơng đối tốt, đạt 11,5%. Một điều đáng chú ý là dòng GC8 là một trong những dòng Việt Nam có khả năng tái sinh từ phôi non
t−ơng đối cao, đã đ−ợc chúng tôi đánh giá và chọn lọc từ tập đoàn ngô Việt Nam. Đây sẽ là dòng ngô triển vọng, có thể sử dụng làm nguồn vật liệu cho các nghiên cứu biến nạp gen ở ngô trong điều kiện Việt Nam.
3.1.2.4. Tối −u hoá quy trình tái sinh phôi từ nuôi cấy bao phấn
a) T−ơng tác giữa thời gian cấy chuyển, khả năng tạo phôi và tái sinh cây từ bao phấn
Trong nuôi cấy bao phấn ngô, hai môi tr−ờng đ−ợc sử dụng. Đó là môi tr−ờng tạo phôi và môi tr−ờng tái sinh. Tác dụng của hai môi tr−ờng này đối với bao phấn là khác nhau. Môi tr−ờng tạo phôi có nhiệm vụ kích thích các tiểu bào tử phát triển thành các cấu trúc dạng phôi (phôi), trong khi đó môi tr−ờng tái sinh lại có nhiệm vụ kích thích các phôi đã hình thành phát triển thành cây.
Chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu ảnh h−ởng của thời gian cấy chuyển mẫu từ môi tr−ờng tạo phôi sang môi tr−ờng tái sinh. Bao phấn nuôi cấy trong môi tr−ờng tạo phôi đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng tái sinh vào các thời điểm khác nhau. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử dụng dòng M24 (dòng ngô nhập nội có phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn). Bao phấn sau khi cấy vào môi tr−ờng tạo phôi đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng tái sinh sau 1, 2, 3, 4 và 5 tuần, các bao phấn đối chứng không đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng tái sinh. Kết quả thí nghiệm đ−ợc trình bày trên bảng 10.
Bảng 10: ảnh h−ởng của thời gian cấy chuyển đến tần số tạo phôi vμ tái sinh cây từ nuôi cấy bao phấn
Thời gian nuôi trên môi tr−ờng tạo phôi
(tuần) Số bao phấn cấy Số phôi thu đ−ợc Tỷ lệ tạo phôi (%) Số cây thu đ−ợc Tỷ lệ cây tái sinh (%) 1 250 22 8.8 1 4.5 2 323 86 26.6 6 7.0 3 298 108 36.2 10 9.3 4 229 103 45.0 6 5.8 5 274 139 50.7 8 5.8
Kết quả bảng 10 cho thấy, tỷ lệ tạo phôi tăng liên tục theo thời gian l−u giữ trong môi tr−ờng tạo phôi. Khi bao phấn hoàn toàn không đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng tái sinh, tỷ lệ tạo phôi là cao nhất (62,5%). Nh−ng ng−ợc lại với việc tăng số l−ợng phôi, tỷ lệ tái sinh cây từ các phôi hình thành lại giảm. ở công thức bao phấn không đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng tái sinh, số phôi hình thành rất lớn, nh−ng những phôi này sau khi đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng tái sinh, khi chúng đạt kích th−ớc 2-3mm, tỷ lệ tái sinh chỉ đạt 2,1% so với 9,3% ở công thức cấy chuyển bao phấn sau 3 tuần. Vì vậy để thu đ−ợc nhiều cây tái sinh cần phải áp dụng chế độ cấy chuyển sớm. Kết quả thu đ−ợc chỉ ra rằng chế độ cấy chuyển sau 3 tuần cho hiệu quả tạo cây cao nhất.
b) Xử lý áp suất thẩm thấu bao phấn tr−ớc khi nuôi cấy
Manitol là loại đ−ờng không hấp thụ và chỉ có vai trò nh− một tác nhân tạo áp suất thẩm thấu của dung dịch rồi từ đó ảnh h−ởng gián tiếp đến trạng thái và khả năng trao đổi chất của tế bào trong dung dịch, gây ảnh h−ởng đến hiệu quả của quá trình nuôi cấy. Mặt khác mannitol có mặt rộng rãi trong thế giới thực vật, kể cả thực vật bậc cao. Các phản ứng sinh hóa biến mannitol thành glucose và fructose và ng−ợc lại đã đ−ợc tìm ra ở nhiều loại thực vật. Nếu hệ thống này có ở ngô thì Mannitol không chỉ đóng vai trò điều hòa áp suất thẩm thấu mà nó còn có thể đóng vai trò dinh d−ỡng nh− một nguồn cácbon. Nhiều thí nghiệm xử lý mannitol ở lúa mỳ đã đ−ợc tiến hành và thu đ−ợc kết quả rất tốt.
Trong thí nghiệm của chúng tôi mannitol đ−ợc bổ sung vào môi tr−ờng tạo phôi IM lỏng với các nồng độ 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8M (công thức thí nghiệm 1-5). Bao phấn sau khi cấy vào môi tr−ờng này đ−ợc giữ trong tối 140C, 4 ngày, sau đó đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng IM có 90g/l saccaro tiếp tục giữ trong tối 140C, 3 ngày rồi chuyển sang giữ trong 270C, trong điều kiện chiếu sáng.
Dòng M24 đã đ−ợc dùng trong thí nghiệm, quy trình thu hái và xử lý cờ đ−ợc tiến hành giống nh− các thí nghiệm tr−ớc. Kết quả thu đ−ợc trình bày ở bảng 11.
ở công thức 1 (đối chứng - không bổ sung mannitol) tỷ lệ tạo phôi là 33,3%. Trong môi tr−ờng IM có bổ sung 0,4M mannitol thì số phôi tạo thành đạt cao nhất
(42,8%). Nếu tiếp tục tăng hàm l−ợng mannitol trong môi tr−ờng lên 0,6; 0,8M thì số phôi giảm dần xuống còn 39,4%; và 22,9% (bảng 11).
Bảng 11. ảnh h−ởng của xử lý áp suất thẩm thấu đối với phản ứng của bao phấn ngô
Công thức 1 2 3 4 5
Số bao phấn cấy 312 354 402 348 297 Số phôi tạo thành 104 107 172 137 68 Tỷ lệ tạo phôi (%) 33.3 30.2 42.8 39.4 22.9
Số cây tái sinh 9 7 7 11 4 Tỷ lệ tái sinh cây (%) 8.7 6.5 4.1 8.0 5.9
Xét khả năng tái sinh cây từ các phôi tạo thành trong môi tr−ờng có bổ sung mannitol ta thấy, khi bổ sung mannitol vào môi tr−ờng IM tỷ lệ cây tái sinh đều giảm so với đối chứng.
Nh− vậy, xử lý áp suất thẩm thấu trong môi tr−ờng có bổ sung mannitol có thể làm tăng tỷ lệ phôi tạo thành, ở nồng độ 0,4 hoặc 0,6M, ở điều kiện 140
C, 4 ngày trong tối để làm tăng hiệu quả của quy trình nuôi cấy.
c) Nghiên cứu ảnh h−ởng của kinetin tới hiệu quả tái sinh cây
Nhìn chung trong nuôi cấy bao phấn ngô tần số tái sinh cây từ phôi tạo thành thấp (3 - 5%), điều này đã đ−ợc nhiều tác giả n−ớc ngoài và trong n−ớc đề cập (Buter,1992, 1993; Lê Huy Hàm & CS, 1996, 1997, 1998). Đã có một số nghiên cứu cải thiện hệ số tái sinh cây từ phôi tạo thành trong nuôi cấy bao phấn, nh− nhân phôi thông qua mô sẹo (Buter & CS, 1993; Saisingtong & CS, 1997; Lê Huy Hàm & CS, 1997), sử dụng các tác nhân gây sốc nh− làm mất n−ớc (Lê Huy Hàm & CS, 1998, 1999). Tuy vậy, phần lớn các nghiên cứu tập trung nhiều đến việc tạo phôi, giai đoạn từ phôi đến cây ch−a đ−ợc chú ý đầy đủ.
Trong thí nghiệm này chúng tôi đã nghiên cứu ảnh h−ởng của cytokinin-kinetin đến khả năng tái sinh cây từ phôi tạo thành.
Giống ngô đ−ợc dùng cho thí nghiệm là M24. Khi phôi tạo thành từ bao phấn nuôi cấy đạt kích th−ớc 2 - 3mm đ−ợc cấy chuyển sang môi tr−ờng tái sinh cây RM có bổ sung kinetin với nồng độ từ 0 – 4 mg/l. Mật độ phôi 30 phôi/đĩa. Đĩa petry với phôi
đ−ợc nuôi trong điều kiện 270C, có chiếu sáng. Kết quả thí nghiệm đ−ợc trình bày trên bảng 12.
Trên môi tr−ờng không có Kinetin có 8,7% phôi tái sinh thành cây. Khi tăng hàm l−ợng kinetin lên 1mg/l, tỷ lệ phôi tái sinh đạt 10,7%. Một số nghiên cứu tr−ớc đây đã thu đ−ợc hệ số tái sinh cây khoảng 3 - 5% khi sử dụng kinetin ở nồng độ từ 2- 2,5mg/l (Buter, 1993; Lê Huy Hàm & CS, 1998, 1999; Saisingtong & CS, 1995; Jumpatong & CS, 1996). Khi hàm l−ợng kinetin tăng lên đến 4mg/l tỷ lệ phôi tái sinh giảm dần xuống.
Bảng 12:ảnh h−ởng của kinetin đến khả năng tái sinh cây từ phôi tạo thμnh trong nuôi cấy bao phấn
Kinetin (mg/L) Số phôi ban đầu Số cây tạo thành Tỷ lệ tái sinh cây (%)
0 126 11 8.7 0,5 142 13 9.2 1 131 14 10.7 2 139 9 6.5 3 127 7 5.5 4 120 4 3.3
Nh− vậy nồng độ Kinetin tối −u cho tái sinh cây từ phôi tạo thành trong nuôi cáy bao phấn là 1mg/l. ở nồng độ này chúng tôi có thể thu đ−ợc 9-10cây/100 phôi tạo thành. Có thể nói với tỷ lệ tái sinh này hiệu quả của quy trình nuôi cấy bao phấn có thể tăng lên 1,5 - 2 lần so với các quy trình thông th−ờng.
d) Nghiên cứu nhân nhanh cụm chồi ngô tạo thành từ nuôi cấy bao phấn
Trong nhiều tr−ờng hợp khi cấy các phôi tạo thành vào môi tr−ờng thích hợp, chúng hình thành các cụm chồi bao gồm rất nhiều chồi. Đây cũng là một trong những khả năng có thể tăng số cây tái sinh và cuối cùng làm tăng hiệu quả của quy trình nuôi cấy bao phấn. Chúng tôi đã nghiên cứu ảnh h−ởng của BAP để nhân nhanh các cụm chồi loại này.
Phôi đ−ợc sử dụng cho thí nghiệm là phôi đ−ợc tạo thành từ nuôi cấy bao phấn dòng M24 theo quy trình nuôi cấy tiêu chuẩn. Môi tr−ờng sử dụng là môi tr−ờng MS/2 bổ sung 30g/l đ−ờng saccaro và hàm l−ợng BAP thay đổi từ 0; 0,5; 1;
1,5; 2,0; 2,5; 3 mg/l. Việc nuôi cấy đ−ợc tiến hành theo điều kiện nuôi cấy mô tiêu chuẩn.
Kết quả thu đ−ợc ở bảng 13 cho thấy hệ số nhân chồi tăng khi tăng nồng độ BAP. Số chồi nhân thay đổi không đáng kể khi nồng độ BAP dao động trong khoảng 0,5-2,5mg/l. Số chồi thu đ−ợc thấp nhất ở môi tr−ờng có nồng độ BAP 3 mg/l (1,05 lần), thấp hơn so với công thức đối chứng.
Bảng 13. ảnh h−ởng của BAP lên quá trình nhân nhanh cụm chồi ngô BAP (mg/l) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Hệ số nhân
chồi 1,2 1,7 1,55 1,65 1,8 1,62 1,05
Hệ số nhân chồi đạt giá trị cao nhất (1,8 lần) ở nồng độ 2 mg/l BAP.