3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1.7. định tắnh và ựịnh lượng carbazole alkaloid, coumarin
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
Cân chắnh xác 5g sản phẩm hoạt chất sinh học mác mật cho vào bình nón khơ, cổ rộng có nút mài, làm ẩm chúng bằng dung dịch amoniac 10% ựến phản ứng với kiềm (khoảng 5ml). Thử bằng giấy chỉ thị màu xem có ựủ kiềm chưa. Thêm vào bình 40ml hỗn hợp ether-cloroform (tỷ lệ 3:1), giữ trong 1 giờ, thỉnh thoảng lắc ựều. Lọc dịch chiết vào bình gạn dung tắch 250ml có chứa sẵn 20ml nước cất và 6ml H2SO4 5%, sau ựó dồn tất cả cặn lên giấy lọc, rửa cặn nhiều lần bằng cloroform cho ựến hết phản ứng alcaloid (kiểm tra bằng thuốc thử mayer). để lắng, sau ựó chiết lớp nước sang bình gạn thứ 2, rửa lớp ether-cloroform bằng H2SO4 5% (2 lần mỗi lần 10ml). Gộp tất cả dịch chiết axit vào bình gạn thứ 2. Kiềm hóa dịch chiết axit bằng dung dịch amoniac 10%, chiết kiệt alkaloid bằng cloroform (3 lần: 10, 10, 5ml), rồi dồn dịch chiết cloroform vào một bình nón dung tắch 50ml. Cơ kiệt và thêm vào cặn (cao chiết) 3ml ether và lại cô kiệt dung môi. Cho vào bình nón có chứa cao chiết alkaloid 10ml dung dịch H2SO4 0,02N, lắc ựều. định lượng H2SO4 thừa bằng dung dịch NaOH 0,02N ựến khi chuyển sang màu vàng (chỉ thị là methyl ựỏ).
Hàm lượng carbazole alkaloid trong mẫu sản phẩm ựược tắnh theo công thức: ( ) ( ) 4 15 - N .0,00578.10 X = , % a 100 - h Trong ựó:
X: Hàm lượng carbazole alkaloid trong mẫu sản phẩm; (%) N: Số ml dung dịch NaOH 0,02N ựã dùng
a: Khối lượng mẫu sản phẩm; (g) h: độ ẩm của mẫu sản phẩm; (%)
b. định tắnh Coumarin bằng các phản ứng mở, ựóng vòng lacton; phản ứng với thuốc thử Diazo và quan sát dưới ánh sáng UV
Cân 2g sản phẩm hoạt chất sinh học từ quả hoặc lá mác mật, rồi hịa tan hồn toàn 100ml cồn etylic 80%. Dung dịch thu ựược dùng ựể làm các phản ứng.
- Phản ứng mở, ựóng vịng lacton:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
. Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% . Ống 2: ựể nguyên
đun cả 2 ống nghiệm ựến sôi, ựể nguội
+ Quan sát: Ống 1 có màu vàng hoặc tủa ựục màu vàng, cịn ống 2 thì trong (phản ứng dương tắnh nếu có)
+ Thêm vào cả 2 ống nghiệm 2ml nước cất lắc ựều và quan sát: Ống 1 trong suốt, cịn ống 2 có tủa ựục
+ Axit hóa ống 1 bằng HCl ựặc, ống 1 ựục như ống 2 (phản ứng dương tắnh nếu có).
- Phản ứng với thuốc thử Diazo:
Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch ựã chuẩn bị ở phần trên, thêm vào ựó 2ml NaOH 10%. đun cách thủy ựến sôi rồi ựể nguội, giỏ vài giọt thuốc thử Diazo, thấy xuất hiện màu ựỏ sim (phản ứng dương tắnh nếu có).
- Quan sát huỳnh quang:
Nhỏ một giọt dung dịch ựã chuẩn bị ở phần trên lên tờ giấy lọc, hơ trên ngọn lửa ựèn cồn cho khơ, nhỏ tiếp lên ựó một giọt NaOH 5%, sấy nhẹ. Che một phần dung dịch trên giấy lọc bằng một miếng kim loại và ựặt tấm giấy lọc dưới ánh sáng UV trong 10 phút. Bỏ miếng kim loại ra và quan sát dưới ựèn UV thấy phần giấy lọc thấm dịch khơng bị che có huỳnh quanh sáng hơn phần bị che, tiếp tục ựặt giấy lọc dưới ánh sáng UV mà không bị che bởi miếng kim loại. Quan sát thấy phần giấy lọc thấm dịch ựã bị che lúc trước sáng dần lên (phản ứng dương tắnh nếu có).