3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1.3. Xác ựịnh hàm lượng protein tổng số theo phương pháp
* Chuẩn bị dịch thắ nghiệm (vơ cơ hố ngun liệu):
- Cân 1 gam mẫu tươi hoặc 0,3 gam mẫu khô ựã ựược nghiền nhỏ. Dùng 01 ống giấy cân cuộn tròn cho cẩn thận mẫu vào tận ựáy bình Kjeldahl dung tắch 50ml.
- Cho thêm 5-10ml H2SO4 ựặc (d=1,84). Nếu là bột khô, trước khi cho thêm axit cần cho vài giọt nước cất khơng có chứa nitơ ựể thấm ướt bột. Khi cho vào bình, khơng ựược ựể mẫu dắnh bám vào cổ bình.
Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
- đậy bằng nút lỏng thuỷ tinh quả hồng hoặc nút thuỷ tinh lọ nhỏ giọt. Lắc nhẹ bình rồi ựặt lên bếp cách cát ựun nhẹ khoảng 30 - 40 phút, sau ựó lấy bình ra ựể nguội.
- Cho vài giọt chất xúc tác axit perocloric (HClO3) hoặc H2O2 30% chỉ cho ở giai ựoạn cuối khi dung dịch ựã có mầu vàng sẫm, hoặc hỗn hợp K2SO4 và CuSO4 với tỷ lệ 3:1, cho 1 lần ngay từ ựầu (lượng hỗn hợp chất xúc tác bằng lượng mẫu tươi dùng ựể vơ cơ hố). Tiếp tục ựốt trên bếp khoảng 30 phút nữa. Dung dịch sẽ chuyển từ mầu ựen sang mầu cánh dán. Nhắc bình ra khỏi bếp, ựể nguội.
- Cho thêm chất xúc tác lần thứ 2 (vài giọt axit perocloric). Tiếp tục ựốt cho ựến khi dịch trong bình khơng mầu. để nguội.
- Chuyển dịch sang bình ựịnh mức 50 hoặc 100 ml, tráng bình Kjeldahl vài lần bằng nước cất khơng có chứa nitơ và lên tới thể tắch ựịnh mức bằng nước cất không chứa nitơ.
* Tiến hành thắ nghiệm (Sử dụng H3BO3 ở bình hứng):
Hình 3.1. Bộ chưng cất Kjeldahl a. Bình ựốt; b. Bình rửa; c. Bình phản ứng
d. Ống làm lạnh; e. Phễu; f. Bình hứng
- Rửa bộ chưng cất Kjeldahl bằng nước cất khơng có nitơ. Lấy 10-20ml dung dịch ựã vơ cơ hóa (tuỳ theo hàm lượng nitơ có trong mẫu) cho vào bình phản ứng (c) qua phễu (e).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
- Cho thêm vài giọt thuốc thử hỗn hợp vào bình phản ứng nếu dùng chất xúc tác bằng HClO3 hoặc H2O2
- Cho vào bình hứng (f) 20 ml dung dịch H3BO3 3%, thêm vài giọt chỉ thị tasiro
- Cho nước từ vòi qua ống làm lạnh (d), ựun sơi nước trong bình ựốt (a) - Cho qua phễu (e) vào bình phản ứng (c) 30ml NaOH 40%
- Mở khố cho kiềm chảy vào bình ựến khi dung dịch trong bình phản ứng ựổi mầu thì ựóng khố lại.
- đun bình ựốt, NH3 trong bình phản ứng bay lên cùng với hơi nước qua ống làm lạnh sang bình hứng và tác dụng với H3BO3 tạo thành muối amoni tetraborat [(NH4)2B4O7]. Quá trình chưng cất ựược tiến hành trong khoảng 30-40phút. Kiểm tra NH3 ựã hết chưa bằng cách hạ thấp bình hứng và thử bằng mẩu giấy ựo pH vào ựầu ống làm lạnh. Khi NH3 ựã ựược cất hồn tồn, hạ bình ựịnh mức xuống, dùng tia nước cất nhỏ tráng sạch axit dắnh ựầu ống làm lạnh.
- định lượng amoni tetraborat tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N cho ựến khi xuất hiện mầu hồng nhạt, phản ứng xảy ra như sau:
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O → (NH4)2SO4 + 4H3BO4 Hàm lượng nitơ tổng số có trong mẫu ựược tắnh theo cơng thức sau:
V.1, 42.100 Nts = (%) W Trong ựó: Nts: Hàm lượng nitơ tổng số; (%) V: Số ml H2SO4 0,1N dùng chuẩn ựộ
1,42: Số mg nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N dư 100: Hệ số chuyển thành %
W: Khối lượng mẫu tắnh bằng mg