để khai thác các chất có hoạt tắnh sinh học từ thực vật, người ta thường sử dụng phương pháp trắch ly.
2.4.1. Nguyên tắc chung
Trắch ly là dùng những dung mơi hữu cơ hịa tan các chất khác, sau khi hòa tan, ta ựược hỗn hợp gồm dung môi và chất cần tách, ựem hỗn hợp này tách dung môi ta sẽ thu ựược chất cần thiết. Cơ sở lý thuyết của quá trình trắch ly là dựa vào sự khác nhau về hằng số ựiện môi của dung môi và chất cần trắch ly. Những chất có hằng số ựiện mơi gần nhau sẽ dễ hịa tan vào nhau. Hợp chất thiên nhiên trong thực vật có hằng số ựiện mơi thấp từ 2 ựến 5. Trong khi ựó hằng số ựiện mơi của các dung môi hữu cơ cũng không cao. Vắ dụ: hexan: 1,89; xăng: 2; benzene: 2,28.
2.4.2. Phương pháp trắch ly
Trong quá trình khai thác các hoạt chất sinh học thì việc lựa chọn ra một phương pháp khai thác thắch hợp là rất quan trọng. Vì nó có ảnh hưởng rất lớn ựến hiệu suất thu nhận, chất lượng sản phẩm và hiệu quả kinh tế thu ựược. Một số phương pháp trắch ly thường ựược sử dụng trong công nghiệp là: trắch ly tĩnh, trắch ly ựộng, trắch ly hồi lưu, trắch ly luân chuyển, trắch ly bằng thiết bị soxlet. Hiện nay, có những nghiên cứu trắch ly hoạt chất sinh học bằng phương pháp CO2 lỏng, CO2 siêu tới hạn và trắch ly có sự trợ giúp của sóng siêu âm cũng bắt ựầu thu ựược những kết quả khả quan.
2.4.3. Dung mơi
Trong q trình trắch ly, chất lượng sản phẩm thu ựược cùng với hiệu suất trắch ly phụ thuộc rất lớn vào dung mơi trắch ly. Nhìn chung, dung mơi cho quá trình trắch ly cần ựạt ựược những yêu cầu sau:
- Hoà tan tốt các chất cần thu nhận có trong nguyên liệu
- Có nhiệt ựộ sơi thấp, tuy nhiên nếu q thấp thì tổn thất dung mơi sẽ rất lớn, trong sản xuất dễ gây hoả hoạn và rất khó làm ngưng tụ ựể thu hồi dung môi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
- Phải tinh khiết, khơng ăn mịn thiết bị, sau khi thu hồi dung môi không ựể lại mùi vị lạ cũng như các sản phẩm ựộc hại trong sản phẩm
- Không hồ tan nước, khơng tác dụng với nước ở bất kỳ nhiệt ựộ nào - Không tạo hỗn hợp nổ với không khắ, khắ cháy
- Có giá thành thấp và dễ mua
Nói chung, hiện nay chưa có một dung môi nào ựáp ứng ựược ựầy ựủ các ựiều kiện như ựã nêu ở trên. Vì vậy, trong quá trình tiến hành, phải căn cứ vào hiệu suất và chất lượng sản phẩm thu nhận ựược, căn cứ vào tắnh kinh tế và an toàn ựể lựa chọn dung môi phù hợp nhất.
2.4.4. Yếu tố cơng nghệ
Có rất nhiều yếu tố cơng nghệ ảnh hưởng ựến quá trình trắch ly nhưng theo một số tài liệu tham khảo, những yếu tố ảnh hưởng rõ rệt nhất ựến hiệu suất thu nhận cũng như chất lượng sản phẩm là số lần trắch ly, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, tốc ựộ khuấy trộn, nhiệt ựộ trắch ly, thời gian trắch ly...
2.5. Ứng dụng của cây mác mật
Cây mác mật ựược liệt vào danh sách 200 cây thuốc quắ có chứa tinh dầu và các chất có hoạt tắnh sinh học có hiệu quả chữa bệnh cao. Ngồi ra, mác mật còn ựược ứng dụng rất nhiều trong cuộc sống hàng ngày của chúng ta. Tất cả các bộ phận của cây mác mật gồm: thân, rễ, lá, cành, cho ựến quả ựều hữu ắch. Từ lâu, con người ựã biết lấy lá mác mật dùng ựể nấu canh hoặc cho vào món ăn. Người Trung Quốc và người dân vùng núi phắa Bắc nước ta ựã sử dụng nguyên liệu mác mật ựể làm phụ gia chế biến các món ăn truyền thống như: vịt quay, lợn quay, thịt kho tầu, chân giò ninh... cho hương vị rất thơm ngon ựặc trưng mà không thể nhầm lẫn với gia vị khác. Rễ ựể làm thuốc, vỏ và hạt tán thành bột ựể làm gia vị. Quả và hạt có ựặc trưng thơm ngọt ựậm ựà có thể dùng ựể ăn tươi hoặc ướp, sấy khô dùng làm gia vị trong cả năm. Quả mác mật to bằng ựầu ngón tay cái, vỏ có màu hồng hoặc trắng là gia vị chủ ựạo trong tất cả các món ăn của người Tày ở Cao Bằng từ thịt kho tàu, thịt lợn, vịt quay ựến bát phở, nồi canh xương. Món ăn chỉ cần có chút mác mật là mùi thơm ựã lan toả khắp phịng [5, 43]. Ngồi ra, mác mật cịn ựược dùng trong ựơng y. Theo kinh nghiệm dân gian Việt Nam, cây mác mật ựược xem như là một loại thuốc ựắng và chát dùng khi ăn uống kém tiêu, ựau
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
bụng, còn dùng ựể chữa ho, cảm, lỵ và sốt rét, rễ sao vàng, sắc ựặc, uống ựể chữa ựau nhức, sưng ựầu gối. Có thể thu lá, vỏ thân và hạt của quả chắn gần như quanh năm ựể làm thuốc. Theo kinh nghiệm dân gian Ấn độ, cây này có tắnh lợi tiểu, quả ựắng, có tác dụng làm chống tiêu cơm. Lá có vị ựắng, có tác dụng tiêu viêm, sát trùng và trừ giun. Ở Indonesia và Trung Quốc, người ta dùng rễ sắc uống ựể chữa ra mồ hôi trộm, lá làm thuốc diệt sâu bọ, và giải ựộc khi bị rắn cắn. Vỏ cây ựược nhân dân Campuchia dùng như là một loại thuốc bổ dạ dày chữa ựau bụng và kém tiêu. Ở Malaysia, người ta còn dùng rễ và lá nấu nước xông. Ở Miền đông Thái Lan, mác mật ựược dùng như 1 loại thuốc ựiều trị bệnh ung thư và một vài bệnh rối loạn. Ở một số nước, lá và cành ựược dùng ựể chữa ựau bụng, ho, ựau ựầu, viêm mũi, ựau nhức cơ thể, chữa lành vết thương, ghẻ cóc, giải ựộcẦ[27,31,36]
Trong những năm gần ựây, mác mật mới thực sự ựược quan tâm và nghiên cứu sâu về các cơng dụng tuyệt vời của nó. Các cơng trình nghiên cứu gần ựây ựã chỉ ra rằng: Tinh dầu mác mật có vị thơm ngọt ựặc trưng và hấp dẫn, khơng chỉ ựược sử dụng trong các món ăn thường ngày mà còn ựược ựưa vào ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm. Các chất có hoạt tắnh sinh học thuộc nhóm (alkaloid, limonoid và coumarin) [24,41,43] có khả năng kháng khuẩn, chống loạn nhịp tim, tác dụng chống ung thư và ựặc biệt là khả năng ngăn chặn sự phát triển của virut HIVẦ Vì vậy, trong tương lai gần các sản phẩm chế biến từ mác mật sẽ ngày càng ựa dạng góp phần phục vụ tốt cho nhu cầu tiêu dùng trong nước và tiến tới xuất khẩu ra nước ngoài, các sản phẩm có giá trị cao như tinh dầu và các chất có hoạt tắnh sinh học sẽ ựược ứng dụng rộng rãi trong các ngành như: Công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm Ầ Góp phần xố ựói giảm nghèo, tăng thu nhập cho người dân và phát triển kinh tế xã hội.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
Phần thứ ba
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu, thời gian, ựịa ựiểm nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu
- Quả và lá mác mật ựược mua tại Cao Bằng, Lạng Sơn và Bắc Giang Nguyên liệu sau khi thu hái ựược sử dụng luôn hoặc bảo quản trong túi nylon hai lớp và bảo quản lạnh ở nhiệt ựộ 50C. Với phương pháp bảo quản này nguyên liệu có thể bảo quản ựược trong khoảng 20 ngày mà hàm lượng và chất lượng tinh dầu trong nguyên liệu thay ựổi không ựáng kể. Tuy nhiên, trước khi ựưa nguyên liệu vào thực hiện thắ nghiệm, chúng tôi ựều tiến hành xác ựịnh ựộ ẩm và hàm lượng tinh dầu ựể quy chuẩn nguyên liệu là cơ sở ựể so sánh ựối chứng các thắ nghiệm sau này.
- Các hóa chất thắ nghiệm
+ Cồn thực phẩm (C2H5OH) 95%V
+ Metanol (CH3OH) 99,5%
+ Etyl acetate (C3H8O2) 99,5%
+ Toluen (C6H5CH3) 99%
+ Amoniac (NH3) 36,6%
+ Natri sulphat khan (Na2SO4)
+ Axit clohydric (HCl) 25% và 6N
+ Dung dịch Iod
+ Natri hydroxit (NaOH) 10%
+ Kali ferricyanide K3Fe(CN)6 0,05N
+ Kali iodua (KI) 1%
+ Kẽm sulphat (ZnSO4) + đồng sulphat (CuSO4)
+ Axit axetic (CH3COOH) 99,5%; 10%
+ Natri thiosulfate (Na2S2O3) 0,05N
+ Dung dịch tinh bột 1%
+ Axit nitric (HNO3)
+ Kali hydroxit (KOH) 0,1N và 0,5N trong etanol + Axit sulfuric (H2SO4) 0,5N và 0,01N
+ Phenol phtalein 2% trong etanol
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
+ Axit percloric (HClO4) + Nước cất
- Thiết bị dùng ựể phân tắch, sản xuất + Bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevender
+ Bộ chưng cất tinh dầu thực nghiệm cỡ nhỏ dung tắch bình cất 10lắt + Sàng có ựường kắnh lỗ 1mm, 2mm, 3mm, 4mm
+ Bộ xác ựịnh hàm ẩm
+ Thiết bị cô quay Buchi B480
+ Tủ hút KOTTERMANN Ờ Germany
+ Tủ sấy tự ựộng khống chế nhiệt ựộ Memmerr Model 500 D06061 + Máy cất ựạm Microkendan
+ Bếp ựiện, bếp cách thuỷ + Cân kỹ thuật, cân phân tắch + Bình hút ẩm
+ Bộ thiết bị trắch ly các loại + Bình cầu các loại
+ Bình ựựng mẫu có nút mài
+ Phễu triết, phễu lọc, cốc ựong, ống ựong, bình ựịnh mức 250ml, 500ml, ựũa thuỷ tinh, bình tam giác các loại
+ Ống nghiệm các loại
+ Bình tỷ trọng dung tắch 50ml + Khúc xạ kế kiểu Abbe
+ Bông hút nước hay vải mầu khô, sạch + Pipet, buret các loại
+ Giấy lọc + Nhiệt kế
+ Máy xay STRAUME Ờ USSR + Dao cắt, kéo
+ Dụng cụ ngâm Ầ
3.1.2. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 04 năm 2011 ựến tháng 05 năm 2012
3.1.3. địa ựiểm nghiên cứu
Thắ nghiệm ựược tiến hành tại: Phòng thắ nghiệm Trung tâm dầu, hương liệu và phụ gia thực phẩm - Viện Công nghiệp thực phẩm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Phân tắch và ựánh giá chất lượng nguyên liệu quả và lá mác mật
Xác ựịnh các thành phần cơ bản của quả và lá mác mật ở 03 vùng nguyên liệu lớn là Cao Bằng, Lạng Sơn và Bắc Giang ựể lựa chọn loại nguyên liệu tốt nhất cho thu nhận tinh dầu và các hoạt chất sinh học. Cụ thể gồm các thông số sau:
- Xác ựịnh ựộ ẩm của quả và lá mác mật
- Xác ựịnh hàm lượng tinh dầu của quả và lá mác mật - Xác ựịnh hàm lượng protein của quả và lá mác mật - Xác ựịnh hàm lượng xelluloza của quả và lá mác mật - Xác ựịnh hàm lượng ựường tổng số của quả và lá mác mật
- Xác ựịnh hàm lượng các hoạt chất sinh học của quả và lá mác mật
3.2.2. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp khai thác tinh dầu và các hoạt chất sinh học từ quả và lá mác mật
Các phương pháp công nghệ nghiên cứu gồm:
- Thu nhận tinh dầu và các hoạt chất sinh học từ quả và lá mác mật bằng phương pháp chưng cất - trắch ly.
- Thu nhận tinh dầu và các hoạt chất sinh học từ quả và lá mác mật bằng phương pháp trắch ly - trắch ly.
3.2.3. Nghiên cứu công nghệ khai thác tinh dầu từ quả và lá mác mật
Nội dung nghiên cứu gồm:
- Nghiên cứu chế ựộ xử lý nguyên liệu trước khi chưng cất gồm: thời gian lưu trữ, ựộ mịn nguyên liệu.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố cơng nghệ ựến q trình chưng cất gồm: áp suất hơi nước, của tỷ lệ khối lượng nguyên liệu/thể tắch thiết bị chưng cất, tốc ựộ chưng cất, nhiệt ựộ nước ngưng, thời gian chưng cất.
3.3.4. Nghiên cứu công nghệ chiết tách các hoạt chất sinh học từ quả và lá mác mật
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ ựến quá trình trắch ly các hoạt chất sinh học từ quả và lá mác mật gồm: nồng ựộ cồn etylic, số lần trắch ly và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian trắch ly.
- Nghiên cứu công nghệ tinh chế các hoạt chất sinh học thô từ quả và lá cây mác mật gồm các nội dung: lựa chọn dung môi tinh chế thắch hợp, xác ựịnh số lần trắch ly thắch hợp, xác ựịnh tỉ lệ sản phẩm thô/dung môi thắch hợp,
3.2.5. Phân tắch và ựánh giá chất lượng sản phẩm
- Phân tắch các chỉ tiêu hoá lý cơ bản của sản phẩm tinh dầu quả và lá mác mật, cụ thể gồm:
+ Hàm lượng nước + Chỉ số khúc xạ + Tỷ trọng + Chỉ số axit
- Phân tắch thành phần hoá học của tinh dầu quả và lá mác mật
- định tắnh và ựịnh lượng các hoạt chất sinh học có trong sản phẩm các hoạt chất sinh học từ quả và lá mác mật
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Các phương pháp phân tắch
3.3.1.1. Xác ựịnh hàm lượng nước trong nguyên liệu bằng phương pháp chưng cất với toluen chưng cất với toluen
Cân chắnh xác 10g nguyên liệu ựã ựược nghiền nhỏ và ựong 100ml toluen ựã ựược làm khô (sao cho ngập nguyên liệu), rồi cho vào bình cầu dung tắch 500ml. Lắp dụng cụ xác ựịnh hàm lượng nước cùng với sinh hàn hồi lưu. đun hỗn hợp trong bình ựến nhiệt ựộ sơi cho tới khi khơng nhìn thấy nước ra ở dụng cụ xác ựịnh hàm lượng nước (thời gian khoảng 02 giờ). đọc thể tắch nước thu ựược ở dụng cụ ựo.
Hàm lượng nước có trong nguyên liệu ựược xác ựịnh theo công thức sau:
V.d.100
X = %
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
Trong ựó:
W: Hàm lượng nước của nguyên liệu; (%) m: Khối lượng nguyên liệu; (g)
V: Thể tắch nước thu ựược ở dụng cụ ựo; (ml) d: Tỷ trọng của nước; (g/ml)
Chú ý:
- Dụng cụ thắ nghiệm phải ựược sấy khơ hồn tồn - Khi làm thắ nghiệm lượng nước làm mát phải ựủ
3.3.1.2. Xác ựịnh hàm lượng tinh dầu trên thiết bị xác ựịnh hàm lượng tinh dầu nhẹ Clevenger dầu nhẹ Clevenger
Cân chắnh xác 100g nguyên liệu ựã ựược nghiền nhỏ và ựong 1.000ml nước cất (sao cho nguyên liệu ngập nước), cho vào bình cầu 2.000ml rồi ựem chưng cất tinh dầu theo phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước bằng bộ xác ựịnh hàm lượng tinh dầu nhẹ Clevenger cùng với sinh hàn hồi lưu. Hàm lượng tinh dầu có trong nguyên liệu ựược xác ựịnh theo công thức:
4 V.d.10
X = %
m(100 - W) Trong ựó:
X: Hàm lượng tinh dầu của nguyên liệu so với tổng lượng chất khô; (%)
m: Khối lượng nguyên liệu; (g)
V: Thể tắch tinh dầu thu ựược ở dụng cụ ựo; (ml) d: Tỷ trọng của nước; (g/ml)
W: Hàm lượng nước của nguyên liệu; (%)
3.3.1.3. Xác ựịnh hàm lượng protein tổng số theo phương pháp Kjeldahl
* Chuẩn bị dịch thắ nghiệm (vơ cơ hố ngun liệu):
- Cân 1 gam mẫu tươi hoặc 0,3 gam mẫu khô ựã ựược nghiền nhỏ. Dùng 01 ống giấy cân cuộn trịn cho cẩn thận mẫu vào tận ựáy bình Kjeldahl dung tắch 50ml.
- Cho thêm 5-10ml H2SO4 ựặc (d=1,84). Nếu là bột khô, trước khi cho thêm axit cần cho vài giọt nước cất khơng có chứa nitơ ựể thấm ướt bột. Khi cho vào bình, khơng ựược ựể mẫu dắnh bám vào cổ bình.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
- đậy bằng nút lỏng thuỷ tinh quả hồng hoặc nút thuỷ tinh lọ nhỏ giọt. Lắc nhẹ bình rồi ựặt lên bếp cách cát ựun nhẹ khoảng 30 - 40 phút, sau ựó lấy bình ra ựể nguội.
- Cho vài giọt chất xúc tác axit perocloric (HClO3) hoặc H2O2 30% chỉ cho ở giai ựoạn cuối khi dung dịch ựã có mầu vàng sẫm, hoặc hỗn hợp K2SO4 và CuSO4 với tỷ lệ 3:1, cho 1 lần ngay từ ựầu (lượng hỗn hợp chất xúc tác bằng lượng mẫu tươi dùng ựể vơ cơ hố). Tiếp tục ựốt trên bếp khoảng 30 phút nữa. Dung dịch sẽ chuyển từ mầu ựen sang mầu cánh dán. Nhắc bình ra