Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR cặp mồi ON1137 và ON1252 sau khi
được đọc trên phần mềm Chromas Pro1.6 có chiều dài là 1530 bp.
Trong đó vùng DNA giữa ITS1, 5.8S và ITS2 có kích thước 620 bp. 3.2.2.3. Xây dựng cây phân loại
Mặc dù chúng tôi giải trình tự toàn bộ vùng gen từ ITS1, 5.8S, ITS2 và vùng D1/D2 của rDNA nhưng qua khảo sát trên GenBank, không có nhiều trình tự các loài nấm được giải trình tự toàn bộvùng gen như trên. Do vậy chúng tôi quyết định sử dụng vùng gen mã hóa cho ITS1, 5.8S và ITS2 để xây dựng cây phân loại của nấm vân chi đỏ.
Kết quả BLAST trên GenBank cho thấy rằng nấm vân chi đỏ có trình tự tương đồng 100% với Trametes sanguinea BRFM 1114 (J.G. Berrin et al., 2012)
Hình 3.22. Kết quả khuếch đại rDNA bằng PCR.
bp
Nấm vân chi đỏ
Kết quả và bàn luận
[47], Trametes sanguinea CR35 và Pycnoporus sanguineus CBS. Mặt khác
Pycnoporus sanguineus là một tên khác của Trametes sanguinea (Hình 1, phụ lục). Nhằm đánh giá chính xác và xác định mối quan hệ của nấm vân chi đỏ với các loài nấm khác, chúng tôi tiếp tục xây dựng cây phân loại.
Các trình tự sau khi tải về được so sánh và chọn vùng khởi đầu và kết thúc thích hợp sử dụng phần mềm Bio Edit Verion 7.1.3. Cây phân loại được vẽ bằng chương trình MEGA 5.0.
Cây phân loại được vẽtheo phương pháp Neighbor-joining tree với độ lặp lại là 1000 lần, các giá trị Boostrap lớn hơn 65% mới được thể hiện.
Theo Hình 3.23: nấm vân chi đỏ tương đồng và không có sự khác biệt về
trình tự DNA với loài Trametes sanguinea BFRM 1114 và có mối quan hệ gần gũi
với các loài khác trong giống Trametes. Dựa vào hình cũng cho thấy rằng giống
Trametes có mối quan hệ gần với loài Ganoderma lucidum và cùng nhóm với loài
Hình 3.23. Cây phân loại thể hiện mối quan hệ họ hàng giữa nấm vân chi đỏ
và các loài nấm khác. Tên chủng của từng loài trong Bảng 3, phụ lục.
Trametes sanguinea BRFM 1114 (JX082366.1) Trametes hirsuta (AB158313.1)
Trametes versicolor BCRC3638 (AY309019.1) Trametes ochracea (AB15314.1)
Ganoderma lucidum CSAA0801 (FJ940919.1) Grifola frondosa AFTOL-ID701 (AY854084.1)
Hericium erinaceus KUMC 1023 (AY534601.1) Tricholoma matsutake TM4 (AB036981.1)
Hypsizygus marmoreus 1196 (FJ609257.1) Pleurotus cystidiosus PSUMC609 (AY315792.1)
Pleurotus floridanus CCRC 36038 (AY265832.1) Pleurotus eryngii 6690 (AY450347.1)
Flammulina velutipes (AF036928.1) Lentinula edodes 50624-ACCC (AY683137.1)
Volvariella volvacea Vv-4(V) (JN086661.1) Nam van chi do
Kết quả và bàn luận
G. frondosa. Bởi vì tất cả đều cùng một bộ đó là bộ Polyporales, ngoại trừ H. erinaceus thuộc bộ Russulales, các loài còn lại đều thuộc bộ Agaricales [71].
Từ kết quả khảo sát trên chúng tôi kết luận nấm vân chi đỏ phân lập tại Việt Nam có tên khoa học là Trametes sanguinea.
3.3. Khảo sát một số đặc điểm sinh lý hai loài nấm
3.3.1. Khảo sát tốc độlan tơ
a
Hình 3.24. Tơ nấm vân chi đỏtrên môi trường PGAY: sau 2 ngày (a), 4 ngày (b), 6 ngày (c), 8 ngày (d), 10 ngày (e), 12 ngày (f).
a b
c d
e f
Kết quả và bàn luận
- Tơ nấm vân chi đỏ bắt đầu mọc, dần dần có màu đỏ cam trên bề mặt môi
trường, tơ nấm cuộn tạo thành những vòng cam đậm, cam nhạt xen kẽ, càng vể sau màu của các vòng ngày càng đậm.
- Tơ nấm vân chi đen có sợi mảnh, trắng đục, bề mặt mịn như bông, sau 6 ngày, tơ nấm cuộn lại tạo thành một vòng tròn, tới ngày thứ 8 phần vòng tròn này tiết ra các giọt nước trên bề mặt, sau 12 ngày các giọt này biến mất.
- Sau 4-5 ngày tơ nấm của hai loài vân chi lan đầy bề mặt đĩa Petri.
d
f a
Hình 3.25.Tơ nấm vân chi đen trên môi trường PGAY: sau 2 ngày (a), 4 ngày (b), 6 ngày (c), 8 ngày (d), 10 ngày (e), 12 ngày (f).
b a
e f
Kết quả và bàn luận
- Tốc độlan tơ của hai loài nấm trên môi trường.
Biểu đồ 3.1. Tốc đô lan tơ của hai loài vân chi sau 2 và 3 ngày.
Theo Biểu đồ3.1 bước sang ngày thứ 2 tơ nấm vân chi đỏ có tốc độ mọc tơ cao hơn do nó thích nghi với môi trường tốt hơn. Nhưng tới ngày thứ 3 tốc độ mọc
tơ của hai loài nấm là gần như tương đương nhau.
3.3.2. Hình thái tơ nấm trên môi trường nuôi cấy lắc
0,94 2,08 0,89 2,06 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 ngày 2 ngày 3 T ố c đ ộ l a n t ơ t ru n g b ìn h (c m /n g à y ) vân chi đỏ vân chi đen
Hình 3.26. Hình thái tơ nấm vân chi
đỏ trong khi nuôi cấy: sau 2 ngày (a), sau 4 ngày (b), sau 5 ngày (c).
a b
Kết quả và bàn luận
Nhận xét:
- Nấm vân chi đỏ sau 2 ngày nuôi cấy tăng trưởng trong môi trường, tạo thành các hạt nhỏ màu trắng, tròn, trơn, nhưng tới ngày thứ 4 nấm tiết sắc tố ra môi
trường, môi trường chuyển thành màu đỏ, sang ngày thứ 5 màu ngày càng đỏ. Lúc này ngừng nuôi cấy. Kích thước hạt từ 0,8-1,5 cm.
- Nấm vân chi đen tạo các hạt lớn hơn so với vân chi đỏ, hình dạng các hạt cơ
bản là tròn với các sợi nấm xuất phát từ bề mặt hạt hướng ra môi trường. Thời gian
tơ nấm tăng trưởng cũng dài hơn khoảng 10 ngày. Kích thước các hạt 1,0-2,5 cm. Theo dõi hình thái của hai loài nấm cũng như thời gian nuôi cấy là bước đầu trong quy trình tách chiết polysaccharide từtơ nấm và dịch nuôi cấy.
3.4. Nuôi trồng hai loài nấm
Trong quá trình nuôi trồng hai loài nấm, có sự khác biệt lớn về nhiệt độ. Một
loài được phân lập từ Việt Nam, một loài là nấm ôn đới được nhập từ Nhật Bản. Do
đó hai loài được trồng ở hai chếđộ nhiệt độ, độ ẩm khác nhau.
3.4.1. Nuôi trồng nấm vân chi đỏ
3.4.1.1. Chuẩn bị giống
Hình 3.27. Hình thái tơ nấm vân chi đen: sau 5 ngày nuôi cấy (a), sau 10 ngày nuôi cấy (b).
Kết quả và bàn luận
Nhận xét:
- Giống cấp 1 là tơ nấm vân chi đỏ trên môi trường thạch PGAY thời gian để đầy ống thạch khoảng 7 ngày.
- Giống cấp 2 là tơ nấm nuôi trên môi trường lúa bổ sung cám gạo, tơ mọc tốt, lan kín toàn bộ chai lúa sau khoảng 20-22 ngày.
- Meo cọng là tơ nấm mọc trên môi trường cọng khoai mì bổ sung cám gạo, thời gian lan kín bịch cọng là 15 ngày.
Đặc điểm chung của tơ nấm mọc trên môi trường màu sắc chuyển dần sang
đỏ, đó là màu sắc của hậu bào tửở nấm vân chi đỏ. Thời gian càng lâu, tơ nấm càng chuyển qua màu đỏ càng nhiều.
3.4.1.2. Quy trình nuôi trồng
Sau khi tơ nấm đầy bịch trên môi trường mạt cưa. Tiến hành đưa vào nhà tưới
đểtơ nấm tiếp tục phát triển thành quả thể. Quy trình trồng nấm như sau:
- Giai đoạn ủ tơ: nhiệt độ phòng nuôi 280C ± 10C, ánh sáng khoảng 50-100 lux.
- Giai đoạn “sốc” nhiệt: thực hiện khi nấm đầy bịch, sốc nhiệt ở 200C trong 1
ngày để kích thích tơ nấm kết nụ.
Hình 3.28. Các cấp giống của vân chi đỏ: giống cấp 1 (a), giống cấp 2 (b), meo cọng (c).
a b c
c b
Kết quả và bàn luận
- Giai đoạn tạo quả thể: giữ nhiệt độổn định ở 280C, lúc này độ ẩm trong nhà trồng cần đạt 92%, ánh sáng điều chỉnh khoảng 200 lux.
- Giai đoạn phát triển quả thể: tăng nhiệt độ lên 290C, giảm độẩm trong không khí xuống 90%, tăng ánh sáng lên 250-500 lux.
Nhận xét:
- Thời gian phát triển tơ nấm trong bịch phôi và thời gian phát triển quả thể là gần như nhau.
- Nấm vân chi đỏ là loài nhiệt đới do vậy nhiệt độ nuôi trồng không quá thấp từ 27-290C.
- Thời gian đầy bịch phôi khoảng 30 ngày. - Ngày 35, nấm bắt đầu mọc nụ nấm. 30 ngày 35 ngày 40 ngày 45 ngày 50 ngày 53 ngày
Hình 3.29. Sự phát triển của nấm vân chi đỏ theo thời gian trên môi
Kết quả và bàn luận
- Ngày 40, nấm hình thành quả thể dạng quạt, vành nấm đang tăng trưởng có màu nhạt hơn phần bên trong.
- Ngày 45, quả thể nấm tiếp tục tăng trưởng.
- Ngày 50, sau một thời gian tăng trưởng, vành của mũ nấm chuyển sang đỏ cam nhưng vẫn nhạt hơn phần bên trong
- Ngày 53, nấm đạt kích thước tối đa. Đây là giai đoạn thu hái nấm trưởng thành, vành nấm hơi quăn.
3.4.2. Nuôi trồng nấm vân chi đen
3.4.2.1. Chuẩn bị giống
Nhận xét:
- Giống cấp 1 là tơ nấm mọc trên môi trường PGAY, nhiệt độ nuôi tơ khoảng 26-280C, tơ nấm lan đầy ống nghiệm trong khoảng 8-10 ngày.
- Giống cấp 2 là tơ nấm mọc trên môi trường lúa bổ sung cám gạo, nhiệt độ
khoảng 26-280C, tơ nấm đầy chai lúa khoảng 30 ngày. Khi tơ nấm mọc được 2/3
chai lúa, tơ nấm tiết ra rất nhiều nước.
- Meo cọng là tơ nấm mọc trên cọng khoai mỳ bổ sung cám gạo, tơ phủ kín bịch cọng trong 26-30 ngày, nhiệt độ nuôi meo khoảng 26-280C.
Hình 3.30. Các cấp giống của vân chi đen: giống cấp 1 (a), giống cấp 2 (b), meo cọng (c).
a b c
Kết quả và bàn luận
Đặc điểm chung của tơ nấm trên các môi trường là màu trắng đục đặc trưng, tơ mảnh, không tạo hậu bào tử, sau một khoảng thời gian mọc đầy, tơ chuyển vàng và tiết nước vàng, đây là giai đoạn tơ nấm bắt đầu già hóa.
3.4.2.2. Quy trình nuôi trồng
Sau khi tơ nấm đầy bịch trên môi trường mạt cưa. Tiến hành đưa vào nhà tưới
đểtơ nấm tiếp tục phát triển thành quả thể. Quy trình trồng nấm như sau:
- Giai đoạn nuôi ủ tơ: nhiệt độ phòng nuôi 26 ± 10C, ánh sáng khoảng 50-100 lux.
- Giai đoạn “sốc” nhiệt: thực hiện khi nấm đầy bịch, sốc nhiệt ở 100C trong 2
ngày để kích thích tơ nấm kết nụ.
- Giai đoạn tạo quả thể: giữ nhiệt độổn định ở 200C, lúc này độ ẩm trong nhà trồng cần đạt 95%, ánh sáng điều chỉnh khoảng 150 lux.
- Giai đoạn phát triển quả thể: tăng nhiệt độ lên 220C, giảm độẩm trong không khí xuống 92%, tăng ánh sáng lên 250 lux.
45 ngày 60 ngày 63 ngày 87 ngày 72 ngày 66 ngày 69 ngày 75 ngày 78 ngày
Kết quả và bàn luận
Nhận xét:
- Thời gian đầy bịch phôi khoảng 45 ngày. - Sau 15 ngày, nụ nấm xuất hiện, màu trắng. - Ngày 66, nấm tạo hình dạng quả thểsơ khai.
- Quả thể phát triển theo hình quạt đến ngày 69 vân đen đầu tiên xuất hiện, 3 ngày sau là vân thứ hai. Vành quả thểđang tăng trưởng nên có màu trắng và tiếp tục tạo các vân đồng tâm.
- Đến 87 ngày nấm phát triển tới kích thước tối đa, vành tăng trưởng chuyển thành màu nâu hoặc đen, lúc này là thời gian thu hái.
Kết luận:
Điểm khác biệt chính của nấm vân chi đen có nguồn gốc từ Nhật Bản và nấm
vân chi đỏ được phân lập ở Việt Nam trong quá trình nuôi trồng là thời gian nuôi trồng ngắn và nhiệt độ cao ở nấm vân chi đỏ.
3.5. Khảo sát các hoạt chất sinh học
3.5.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học
Quả thể sau khi sấy khô được nghiền thành bột, bột nấm vân chi đỏ (VĐ) có
màu đỏ cam. Trong khi bột nấm vân chi đen (VCĐ) có màu xám nhạt.
Hình 3.31. Sự phát triển của nấm vân chi đen theo thời gian trên môi trường mạt cưa.
Kết quả và bàn luận
Nguyễn Thị Thu Trang 65
Bảng 3.2. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học nấm vân chi đỏvà đen. Chất Phản ứng dương tính (+) Kết quả Hình minh họa VĐ VCĐ Anthraglycosid Màu đỏ - - Flavonoid Màu đỏ - -
Acid béo Trên tờ giấy lọc
để lại vết mờ - - Alkaloid Kết tủa vàng nhạt với thuốc thử Mayer, kết tủa vàng cam với thuốc thử Dragendorff, kết tủa nâu với thuốc thử Wagner + +
Tinh dầu Có mùi thơm - -
Kết quả và bàn luận
Nguyễn Thị Thu Trang 66 Phytosterol
Chỗ giáp giới có màu vàng lục hay lục đỏ
- -
Steroid Màu xanh + -
Tanin Màu xanh đen - -
Acid hữu cơ Sủi bọt + +
Anthocyanosid
Màu đỏ với acid hóa, màu xanh khi kiềm hóa
+ -
Saponin Lắc mạnh có bọt
bền + +
Kết quả và bàn luận
Hợp chất Uronic Có tủa nhiều - -
Kết luận:
Từbước khảo sát sơ bộ cho thấy rằng:
- Những hợp chất có trong nấm vân chi đỏ: alkaloid, carotenoid, steroid, acid hữu cơ, anthocyanosid, saponin và đường khử.
- Những hợp chất có trong nấm vân chi đen: alkaloid, carotenoid, acid hữu cơ, saponin và đường khử.
- Điểm khác biệt chính giữa các thành phần của hai loài vân chi này là steroid và anthocyanosid. Hai chất này hiện diện trong dịch ly trích của nấm vân chi đỏ và không có trong nấm vân chi đen.
3.5.2. Định lượng β-1,3-glucan
Kết quảđịnh lượng β-1,3-glucan được phân tích tại Phòng Thí Nghiệm Phân
Tích Trung Tâm, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên (phụ lục).
Kết quả và bàn luận
Hình 3.35. Sắc ký đồ của dịch chiết nấm vân chi đỏ thêm β-1,3-glucan chuẩn.
Hình 3.34. Sắc ký đồ của dịch chiết nấm vân chi đỏ.
Kết quả và bàn luận
β-1,3-glucan được phát hiện tại thời gian 19,271 phút, bước sóng 272,5 nm (Hình 3.33). Tuy nhiên trong dịch chiết nấm vân chi đỏ không phát hiện phân đoạn
β-1,3-glucan trọng lượng 500000 Da, khi thêm β-1,3-glucan chuẩn thì mới thấy sự
xuất hiện của β-1,3-glucan tại 19,340 phút. Chứng tỏ, trong dịch chiết nấm vân chi
đỏ không có sự hiện diện của phân đoạn β-1,3-glucan trọng lượng 500000 Da (Hình 3.34, 3.35).
Trong khi đó, dịch chiết nấm chi đen phát hiện được sự có mặt của phân
đoạn β-1,3-glucan tại 19,351 phút, khi thêm β-1,3-glucan chuẩn vẫn thấy có sự xuất hiện của β-1,3-glucan (Hình 3.36, 3.37). Chứng tỏ, trong dịch chiết nấm vân chi đen có phân đoạn β-1,3-glucan 500000 Da với nồng độ là 140,85 µg/ml.
Pick tại thời gian 24 phút sẽ chứa polysaccharide có trọng lượng lớn ở nấm
vân chi đỏ, trong khi đó pick này không có ở nấm vân chi đen. Đây là một đặc điểm thú vị có thể khảo sát ứng dụng liên quan tới khảnăng chống ung thư vì dịch chiết nấm có rất nhiều phân đoạn polysaccharide với trọng lượng khác nhau [12]. Mặc dù trong dịch chiết nấm vân chi đỏ không phát hiện được phân đoạn β-1,3-glucan có trọng lượng 500000 Da nhưng theo kết quả có được theo Hình 3. 34 có khoảng 4 pick khác ngoài pick của β-1,3-glucan 500000 Da, do đó có thể còn những phân
đoạn polysaccharide khác trong dịch chiết nấm vân chi đỏ. Trong Hình 3.36, ngoài pick của β-1,3-glucan còn có hiện diện của khoảng 2 pick khác vì vậy trong dịch chiết của nấm vân chi đen vẫn còn những phân đoạn polysaccharide khác. Trong kết quả thấy được sốlượng pick thấy trên sắc ký đồ của nấm vân chi đỏ nhiều hơn nấm
vân chi đen.
Kết quả và bàn luận Hình 3.39. Chỉ số bọt vân chi đỏ. 3.5.3. Định tính và định lượng saponin 3.5.3.1. Định tính saponin Thử nghiệm tạo bọt Định tính tạo bọt
Kết quả định tính cho thấy rằng cả vân chi đỏ và đen đều cho bọt bền sau 60 phút (+++).
Xác định chỉ số bọt
Hình 3.38. Khảnăng tạo bọt của hai loài vân chi: lúc 0 phút (a), 30 phút (b), và 60 phút (c). 1-vân chi
đỏ, 2-vân chi đen.
A b 2 1 1 2 a c 1 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 3.40. Chỉ số bọt vân chi đen.
Kết quả và bàn luận
Từ kết quả thực nghiệm cho thấy rằng: