2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.2. Phân loại dựa trên DNA Ribosome
Vật liệu và phương pháp
Nguyễn Thị Thu Trang 30
Hai lồi nấm vân chi ni cấy trên mơi trường PGAY, sau đó ni trong 25
ml môi trường lỏng PGY. Nuôi cấy lắc trong tối ở 250C trong 10 ngày với tốc độ 150 vòng/phút. Sau 10 ngày rửa với nước cất vô trùng, ly tâm để thu sinh khối [44].
Phương pháp tách chiết DNA bộ gen của nấm dựa trên phương pháp [67]:
- 0,3 g mẫu cho vào eppendorf 1,5 ml với 300 µl đệm Lysis (10 mM Tris-HCl pH 7,5; 0,5M NaCl và SDS 1%).
- Bổ sung 600 µl phenol:chloroform (1:1). - Ủ 650C trong vòng 30 phút.
- Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút, dịch nổi được tái tách chiết bằng phenol:chloroform.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, pha nước (400 µl) thu lại, sau đó cho vào 40µl sodium acetate, 800 µl isopropanol sau đó trộn đều.
- Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi. DNA thu được
rửa một lần với ethanol 70%, làm khơ tự nhiên trong vịng 30 phút.
- Bổ sung 50 µl TE (Tris-HCl pH 8,0; 1,0 mM EDTA) chứa Rnase A (60 µg)
lưu trữ mẫu trong tủ lạnh ở 40C.
Thu nhận vùng gen DNA ribosome
Trình tự ITS1, 5.8S, ITS2 và vùng gen mã hóa cho tiểu phần lớn D1/D2 của
RNA ribosome được nhân bản, sử dụng ba cặp mồi ON1137 và ON1138 (khoảng
623 bp), ON1137 và ON1252 (1483 bp) và ON1181 và ON1252 (880 bp): - ON1137 (ITS1) (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)
- ON1138 (ITS4) (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)
- ON1181 (NL1) (5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) - ON1252 (28SH4lv1) (5’-ACGATCGATTTGCACGTCAG-3’) [88]. Phản ứng PCR [64]: 4,0 µl DNA mẫu 10,5 µl H20 2,0 µl buffer 2,0 µl dNTPs 2 mM (dATP, dGTP, dCTP và dTTP)
Vật liệu và phương pháp
Nguyễn Thị Thu Trang 31
0,5 µl mồi
0,1 µl Tag polymerase Tổng thể tích 20 µl. Chu kỳ:
Bước biến tính ban đầu ở 940C trong 10 phút Biến tính ở 940C trong 30s
Bắt cặp ở 550C trong 30s Kéo dài ở 720C trong 2 phút
Quá trình PCR trong 30 chu kỳ và sau đó thêm bước kéo dài ở 720C trong 10 phút.
Sản phẩm PCR (2 µl) được điện di với 2% gel agarose chứa EtBt trong đệm Tris-acetate EDTA (TAE). Quan sát và chụp hình dưới hộp đèn UV.
Sản phẩm PCR của nấm vân chi đỏ được xử lý bằng ExoSAP-IT PCR clear up. Quy trình như sau:
- Sản phẩm PCR 5 µl được ủ với 2 µl ExoSAP-IT. - Trộn đều và ủ ở 370C trong 15 phút.
- Bất hoạt ExoSAP-IT bằng cách đun nóng ở 800C trong 15 phút.
- DNA của mẫu nấm vân chi đỏ từ cặp mồi ON1137 và ON1252 sau khi được xử lý xong sẽ được dùng cho các bước tiếp theo.
Sản phẩm sau khi xử lý xong sẽ được trộn với các mồi ON1137, ON1138 và ON1181 và gửi mẫu tới công ty Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự.
Xây dựng cây phân loại dựa vào DNA ribosome
Tất cả các vùng gen sau khi được giải trình tự sẽ được chỉnh sửa bằng phần mềm Chromas Pro1.6 và Bio Edit Verion 7.1.3. Sau đó sử dụng chương trình BLAST-chương trình phân tích các trình tương đồng trên GenBank nhằm lựa chọn một số trình tự để xây dựng cây phát sinh loài [104]. Cây phát sinh loài được xây
dựng dựa vào chương trình MEGA 5.0.