Nguyên tắc
Saponin là một nhóm glucoside có cấu trúc triterpene hoặc steroid. Saponin có tính chất chung như tạo bọt bền khi lắc với nước, làm vỡ hồng cầu ở nồng độ
thấp, độc với cá, tạo phức với cholesterol hay với các dẫn chất β-hydroxide steroid. Các tính chất này thường được dùng để định tính và đánh giá saponin. Các phản
ứng hóa học cũng được sử dụng nhưng mức độđặc hiệu thấp hơn so với các nhóm hợp chất khác.
Các saponin thường dễtan trong ethanol, methanol, butanol, nước và các hỗn hợp cồn nước, khó tan hoặc không tan trong các dung môi kém phân cực. Dạng aglycon (sapogenin) thì ngược lại, dễ tan trong dung môi kém phân cực, kém tan
trong nước. Các tính chất này thường được dùng để chiết xuất và tinh chế saponin [1].
Hóa chất và thiết bị Hóa chất
- Cồn 70% - Dung dịch đẳng trương NaCl 0,9%
Vật liệu và phương pháp
Nguyễn Thị Thu Trang 40
- Diethyl eter - Môi trường thạch máu - Anhydrid acetic - H2SO4đậm đặc
Thiết bị và dụng cụ
- Cân kỹ thuật - Cân phân tích - Hệ thống Soxhlex - Hệ thống máy cô quay - Tủ sấy - Ống nghiệm 1,6 x16 cm; 1,8 x18 cm - Erlen 250 ml - Ống đong 100 ml - Pipette 1 ml, 10 ml. Phương pháp tiến hành Phương pháp định tính Saponin Thử nghiệm tạo bọt Định tính tạo bọt
Cho 0,5 g nấm vào ống nghiệm, thêm vào 10 ml cồn 70%, đun nhẹ trên bếp cách thủy trong 5 phút rồi lọc nóng qua bông.
Bốc hơi dung môi trên cách thủy cho đến còn khoảng 2 ml, lấy 10 giọt dịch chiết đậm đặc này cho vào ống nghiệm 1,6 x 16 cm đã có sẵn 10 ml nước cất.
Dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút (30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá
kết quả.
Đánh giá kết quả: bọt bền trong 15 phút (+), 30 phút (++), 60 phút (+++)
Xác định chỉ số bọt (CSB)
Cân chính xác 1,0 g nấm (đã qua rây 0,5 mm) cho vào một Erlen 250 ml, thêm 100 ml nước cất sôi. Đun cách thủy trong 30 phút, lọc nóng qua giấy lọc (hay bông) vào một Becher, khi dịch lọc nguội thì nhẹ nhàng chuyển dịch lọc vào một bình định mức 100 ml, dùng nước cất tráng Becher rồi thêm vào bình định mức cho
Vật liệu và phương pháp
Nguyễn Thị Thu Trang 41
đủ 100 ml. Dung dịch này được gọi là dung dịch A (có độ pha loãng ban đầu là 100 lần).
Lấy 10 ống nghiệm 1,6 x 16 cm, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Cho vào mỗi
ống nghiệm lần lượt 1 ml, 2 ml, 3 ml,….,9 ml, 10 ml dung dịch A. Thêm nước cất cho mỗi ống nghiệm cho đủ 10 ml.
Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 15 giây (30 lần lắc). Để yên ống nghiệm 15 phút và đo độ cao của cột bọt trong ống nghiệm.
Xác định kết quả:
- Trường hợp 1: nếu tất cả các ống nghiệm đều có cột bọt < 1 cm thì chỉ số bọt của mẫu sẽ nhỏhơn 100 đơn vị (CBS < 100).
- Trường hợp 2: nếu tất các ống nghiệm đều có cột bọt > 1 cm thì CBS >1000.
Trường hợp này ta phải pha loãng dung dịch A (đang có độ pha loãng là 100) thêm
k lần nữa (10, 50, 100 lần hoặc nhiều hơn nữa) cho đến khi có được một ống nghiệm có cột bọt bền vững cao 1 cm nằm ở giữa các mẫu, k khi ấy được gọi là độ
pha loãng trung gian. Nếu không cần pha loãng thên dung dịch A, khi ấy k =1. - Trường hợp 3: nếu 1 trong số 10 ống nghiệm có cột bọt cao đúng 1 cm thì chỉ số bọt chính là độ pha loãng của dung dịch trong ống nghiệm này.
- Trường hợp 4: nếu 2 ống nghiệm liên tiếp có cột bọt gần với trị số 1 cm (ống thứ [m] có cột bọt hơi thấp hơn 1 cm, ống [m+1] có cột bọt hơi cao 1 cm thì CBS có thểđược tính bằng phép nội suy từ 2 ống nghiệm ấy.
Ak x n CBS Trong đó: n: số thứ tự của ống có cột bọt cao 1 cm A: độ pha loãng của dung dịch đầu
k: độ pha loãng trung gian.
Thử nghiệm tính phá huyết
Vật liệu và phương pháp
Nguyễn Thị Thu Trang 42
Nhỏ một giọt máu (đã loại fibrin) lên một lam kính. Thêm 2-3 giọt dung dịch
đệm, soi trên kính hiển vi (40x) sẽ thấy các hồng cầu nguyên vẹn. Nhỏ tiếp lên lam kính 2-3 giọt dung dịch 1% (trong dung dịch đệm). Quan sát hiện tượng vỡ hồng cầu qua kính hiển vi.
Định tính trên đĩa thạch máu
Dùng dụng cụ đục lỗ, đục 5 lỗ trên đĩa thạch máu. Dùng Pipette nạp một thể tích như nhau các dịch chiết saponin có nồng độ khác nhau (pha trong dung dịch
đẳng trương NaCl 0,9%) vào, khoảng 2/3 giếng thử (nhớ ghi chú mặt sau đáy đĩa). Để yên rồi quan sát và đo đường kính (d, cm) của vòng phá huyết ở từng giấy giếng thử sau 12-24 giờ.
Định lượng saponin
Cân 10 g nấm đã được xác định độ ẩm. Chiết với 200 ml methanol trong Soxhlex từ 6-8 giờ. Dịch chiết được cô dưới áp suất giảm (cô quay) đến khi còn khoảng 50 ml.
Cho toàn bộ dịch chiết nóng này vào một Erlen nút mài 250 ml, để nguội. Thêm vào Erlen này 150 ml ether ethylic, lắc đều, đậy kín và để hỗn hợp qua đêm ở nơi mát.
Gạn bớt dịch trong ở phía trên, phần còn lại được lọc lấy tủa, rửa tủa với 10 ml ether ethylic rồi cho rửa và một Erlen 200 ml, hòa tan bằng cách đun nóng với 50 ml methanol. Làm nguội và kết tủa lại lần nữa với 150 ml ether ethylic. Để dung dịch ởnơi mát cho đến khi lắng hoàn toàn. Gạn bớt dịch trong phía trên, phần còn lại được ly tâm (hoặc lọc hút) lấy tủa. Rửa tủa với ether ethylic (3 lần x 10 ml).
Cho tủa này vào một chén kết tinh đã cân bì, sấy ở 500C cho đến khô. Cho vào bình hút ẩm, cân và tính hàm lượng (%) của saponin có trong dược liệu.