3.4.2.1. Chuẩn bị giống
Nhận xét:
- Giống cấp 1 là tơ nấm mọc trên môi trường PGAY, nhiệt độ nuôi tơ khoảng 26-280C, tơ nấm lan đầy ống nghiệm trong khoảng 8-10 ngày.
- Giống cấp 2 là tơ nấm mọc trên môi trường lúa bổ sung cám gạo, nhiệt độ
khoảng 26-280C, tơ nấm đầy chai lúa khoảng 30 ngày. Khi tơ nấm mọc được 2/3
chai lúa, tơ nấm tiết ra rất nhiều nước.
- Meo cọng là tơ nấm mọc trên cọng khoai mỳ bổ sung cám gạo, tơ phủ kín bịch cọng trong 26-30 ngày, nhiệt độ nuôi meo khoảng 26-280C.
Hình 3.30. Các cấp giống của vân chi đen: giống cấp 1 (a), giống cấp 2 (b), meo cọng (c).
a b c
Kết quả và bàn luận
Đặc điểm chung của tơ nấm trên các môi trường là màu trắng đục đặc trưng, tơ mảnh, không tạo hậu bào tử, sau một khoảng thời gian mọc đầy, tơ chuyển vàng và tiết nước vàng, đây là giai đoạn tơ nấm bắt đầu già hóa.
3.4.2.2. Quy trình nuôi trồng
Sau khi tơ nấm đầy bịch trên môi trường mạt cưa. Tiến hành đưa vào nhà tưới
đểtơ nấm tiếp tục phát triển thành quả thể. Quy trình trồng nấm như sau:
- Giai đoạn nuôi ủ tơ: nhiệt độ phòng nuôi 26 ± 10C, ánh sáng khoảng 50-100 lux.
- Giai đoạn “sốc” nhiệt: thực hiện khi nấm đầy bịch, sốc nhiệt ở 100C trong 2
ngày để kích thích tơ nấm kết nụ.
- Giai đoạn tạo quả thể: giữ nhiệt độổn định ở 200C, lúc này độ ẩm trong nhà trồng cần đạt 95%, ánh sáng điều chỉnh khoảng 150 lux.
- Giai đoạn phát triển quả thể: tăng nhiệt độ lên 220C, giảm độẩm trong không khí xuống 92%, tăng ánh sáng lên 250 lux.
45 ngày 60 ngày 63 ngày 87 ngày 72 ngày 66 ngày 69 ngày 75 ngày 78 ngày
Kết quả và bàn luận
Nhận xét:
- Thời gian đầy bịch phôi khoảng 45 ngày. - Sau 15 ngày, nụ nấm xuất hiện, màu trắng. - Ngày 66, nấm tạo hình dạng quả thểsơ khai.
- Quả thể phát triển theo hình quạt đến ngày 69 vân đen đầu tiên xuất hiện, 3 ngày sau là vân thứ hai. Vành quả thểđang tăng trưởng nên có màu trắng và tiếp tục tạo các vân đồng tâm.
- Đến 87 ngày nấm phát triển tới kích thước tối đa, vành tăng trưởng chuyển thành màu nâu hoặc đen, lúc này là thời gian thu hái.
Kết luận:
Điểm khác biệt chính của nấm vân chi đen có nguồn gốc từ Nhật Bản và nấm
vân chi đỏ được phân lập ở Việt Nam trong quá trình nuôi trồng là thời gian nuôi trồng ngắn và nhiệt độ cao ở nấm vân chi đỏ.
3.5. Khảo sát các hoạt chất sinh học
3.5.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học
Quả thể sau khi sấy khô được nghiền thành bột, bột nấm vân chi đỏ (VĐ) có
màu đỏ cam. Trong khi bột nấm vân chi đen (VCĐ) có màu xám nhạt.
Hình 3.31. Sự phát triển của nấm vân chi đen theo thời gian trên môi trường mạt cưa.
Kết quả và bàn luận
Nguyễn Thị Thu Trang 65
Bảng 3.2. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học nấm vân chi đỏvà đen. Chất Phản ứng dương tính (+) Kết quả Hình minh họa VĐ VCĐ Anthraglycosid Màu đỏ - - Flavonoid Màu đỏ - -
Acid béo Trên tờ giấy lọc
để lại vết mờ - - Alkaloid Kết tủa vàng nhạt với thuốc thử Mayer, kết tủa vàng cam với thuốc thử Dragendorff, kết tủa nâu với thuốc thử Wagner + +
Tinh dầu Có mùi thơm - -
Kết quả và bàn luận
Nguyễn Thị Thu Trang 66 Phytosterol
Chỗ giáp giới có màu vàng lục hay lục đỏ
- -
Steroid Màu xanh + -
Tanin Màu xanh đen - -
Acid hữu cơ Sủi bọt + +
Anthocyanosid
Màu đỏ với acid hóa, màu xanh khi kiềm hóa
+ -
Saponin Lắc mạnh có bọt
bền + +
Kết quả và bàn luận
Hợp chất Uronic Có tủa nhiều - -
Kết luận:
Từbước khảo sát sơ bộ cho thấy rằng:
- Những hợp chất có trong nấm vân chi đỏ: alkaloid, carotenoid, steroid, acid hữu cơ, anthocyanosid, saponin và đường khử.
- Những hợp chất có trong nấm vân chi đen: alkaloid, carotenoid, acid hữu cơ, saponin và đường khử.
- Điểm khác biệt chính giữa các thành phần của hai loài vân chi này là steroid và anthocyanosid. Hai chất này hiện diện trong dịch ly trích của nấm vân chi đỏ và không có trong nấm vân chi đen.
3.5.2. Định lượng β-1,3-glucan
Kết quảđịnh lượng β-1,3-glucan được phân tích tại Phòng Thí Nghiệm Phân
Tích Trung Tâm, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên (phụ lục).
Kết quả và bàn luận
Hình 3.35. Sắc ký đồ của dịch chiết nấm vân chi đỏ thêm β-1,3-glucan chuẩn.
Hình 3.34. Sắc ký đồ của dịch chiết nấm vân chi đỏ.
Kết quả và bàn luận
β-1,3-glucan được phát hiện tại thời gian 19,271 phút, bước sóng 272,5 nm (Hình 3.33). Tuy nhiên trong dịch chiết nấm vân chi đỏ không phát hiện phân đoạn
β-1,3-glucan trọng lượng 500000 Da, khi thêm β-1,3-glucan chuẩn thì mới thấy sự
xuất hiện của β-1,3-glucan tại 19,340 phút. Chứng tỏ, trong dịch chiết nấm vân chi
đỏ không có sự hiện diện của phân đoạn β-1,3-glucan trọng lượng 500000 Da (Hình 3.34, 3.35).
Trong khi đó, dịch chiết nấm chi đen phát hiện được sự có mặt của phân
đoạn β-1,3-glucan tại 19,351 phút, khi thêm β-1,3-glucan chuẩn vẫn thấy có sự xuất hiện của β-1,3-glucan (Hình 3.36, 3.37). Chứng tỏ, trong dịch chiết nấm vân chi đen có phân đoạn β-1,3-glucan 500000 Da với nồng độ là 140,85 µg/ml.
Pick tại thời gian 24 phút sẽ chứa polysaccharide có trọng lượng lớn ở nấm
vân chi đỏ, trong khi đó pick này không có ở nấm vân chi đen. Đây là một đặc điểm thú vị có thể khảo sát ứng dụng liên quan tới khảnăng chống ung thư vì dịch chiết nấm có rất nhiều phân đoạn polysaccharide với trọng lượng khác nhau [12]. Mặc dù trong dịch chiết nấm vân chi đỏ không phát hiện được phân đoạn β-1,3-glucan có trọng lượng 500000 Da nhưng theo kết quả có được theo Hình 3. 34 có khoảng 4 pick khác ngoài pick của β-1,3-glucan 500000 Da, do đó có thể còn những phân
đoạn polysaccharide khác trong dịch chiết nấm vân chi đỏ. Trong Hình 3.36, ngoài pick của β-1,3-glucan còn có hiện diện của khoảng 2 pick khác vì vậy trong dịch chiết của nấm vân chi đen vẫn còn những phân đoạn polysaccharide khác. Trong kết quả thấy được sốlượng pick thấy trên sắc ký đồ của nấm vân chi đỏ nhiều hơn nấm
vân chi đen.
Kết quả và bàn luận Hình 3.39. Chỉ số bọt vân chi đỏ. 3.5.3. Định tính và định lượng saponin 3.5.3.1. Định tính saponin Thử nghiệm tạo bọt Định tính tạo bọt
Kết quả định tính cho thấy rằng cả vân chi đỏ và đen đều cho bọt bền sau 60 phút (+++).
Xác định chỉ số bọt
Hình 3.38. Khảnăng tạo bọt của hai loài vân chi: lúc 0 phút (a), 30 phút (b), và 60 phút (c). 1-vân chi
đỏ, 2-vân chi đen.
A b 2 1 1 2 a c 1 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 3.40. Chỉ số bọt vân chi đen.
Kết quả và bàn luận
Từ kết quả thực nghiệm cho thấy rằng:
- Cột số 7 có chiều cao cột bọt bằng 1 cm do vậy chỉ số tạo bọt của nấm vân
chi đó là 142,85 đơn vị.
- Không có ống nghiệm dịch chiết nấm vân chi đen nào có chiều cao cột bọt cao bằng hoặc lớn hơn 1cm do đó CBS của nấm vân chi đen nhỏhơn 100đơn vị.
Định tính trên lam kính
Kết quả từ Hình 3.41 và 3.42 chứng minh rằng:
Trong dung dịch đẳng trương hồng cầu có hình dạng bình thường, hình đĩa
tròn. Sau khi nhỏ dịch chiết quả thể hai loài nấm, hồng cầu bị vỡ thành nhiều hình dạng khác nhau.
Định tính trên đĩa thạch máu
Hình 3.42. Hồng cầu trước và sau khi nhỏ dịch chiết nấm vân chi đen (40x).
Kết quả và bàn luận
Từ Hình 3.43 cho thấy rằng: sau 12 giờ dịch chiết nấm vân chi đỏ có nồng độ
là 0,8 và 1, tạo vòng tan huyết nhưng rất nhỏ, sau 24 giờ vòng tan huyết nhìn thấy rất rõ và tại nồng độ 0,4 và 0,6 cũng quan sát được vòng tan huyết.
Từ Hình 3.44 cho thấy rằng: sau 12 giờ chỉ có nồng độ dịch chiết nấm vân
chi đen là 1 mới thấy được vòng tan huyết, sau 24 giờ vòng tan huyết rất rõ và tại nồng độ 0,8 cũng quan sát được vòng tan huyết.
Hình 3.43.Đĩa thạch máu khi nhỏ dịch chiết nấm vân chi đỏ theo những nồng
độ khác nhau: sau 12 giờ (a), sau 24 giờ (b).
Hình 3.44. Đĩa thạch máu khi nhỏ dịch chiết nấm vân chi đen theo những nồng
độ khác nhau: sau 12 giờ (a), sau 24 giờ (b).
0,2 0,4 0,8 1 0,6 0,2 0,4 0,8 0,6 1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 a b a b
Kết quả và bàn luận
Nguyễn Thị Thu Trang 73
Bảng 3.3. Đường kính (cm) vòng tan huyết của dịch chiết nấm vân chi đỏ và
đenở các nồng độ khác nhau. Nồng độ
Mẫu
0,2 0,4 0,6 0,8 1
Vân chi đỏ 1,23 ± 0,03 1,35 ± 0,05 1,43 ± 0,08 1,60 ± 0,05
Vân chi đen 1,30 ± 0,05 1,35 ± 0,05 1,58 ± 0,03
Nhận xét:
Từ các kết quảđịnh tính ở trên chứng minh rằng quả thể nấm vân chi đỏ và
đen có saponin. Nhận định ban đầu nấm vân chi đỏ có nhiều saponin hơn nấm vân
chi đen.
3.5.3.2. Định lượng saponin
Kết quả định lượng sơ bộ saponin chiếm 0,142% trọng lượng nấm vân chi
đỏ và 0,055% trọng lượng nấm vân chi đen.
Kết quả định lượng khẳng định nấm vân chi đỏ có hàm lượng saponin cao
Chương 4
KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ
Kết luận và kiến nghị
Nguyễn Thị Thu Trang 74
4.1. Kết luận
- Phân loại được nấm vân chi đỏ có tên khoa học là Trametes sanguinea.
- Khảo sát được hai đặc điểm sinh lý của nấm vân chi đỏ và đen qua tốc độ lan tơ nấm và hình thái tơ nấm trên môi trường nuôi cấy lắc.
- Nuôi trồng được hai loài nấm này trên môi trường mạt cưa. - Khảo sát sơ bộ các hợp chất sinh học có trong hai loài nấm:
Những hợp chất có trong nấm vân chi đỏ: alkaloid, carotenoid, steroid, acid hữu cơ, anthocyanosid, saponin và đường khử.
Những hợp chất có trong nấm vân chi đen: alkaloid, carotenoid, acid hữu cơ, saponin và đường khử.
- β-1,3-glucan của nấm vân chi đỏ không có pick tương ứng với chất chuẩn 500000 Da nhưng có khả năng có pick có trọng lượng lớn hơn nhiều so với chất chuẩn mà pick này không xuất hiện.
- Hàm lượng saponin của nấm vân chi đỏ chiếm 0,142% trọng lượng nấm vân chi đỏ và 0,055% trọng lượng nấm vân chi đen.
4.2. Kiến nghị
Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên còn nhiều vấn đề chưa thực hiện được. Do đó, chúng tôi đề nghị:
- Nghiên cứu thêm đặc điểm sinh lý nuôi trồng của nấm vân chi đỏ để nhanh chóng đưa vào sản xuất.
PHỤ LỤC
Công thức pha chế các loại thuốc thử
- Thuốc thử Mayer: hòa tan 1,358 g HgCl2 trong 60 ml nước cất, thêm dung dịch chứa 5 g KI trong 10 ml nước, thêm nước cho đủ 100 ml.
- Thuốc thử Wagner: hòa tan 1,27 g I2và 2 g KI trong 20 ml nước, thêm nước vừa đủ 100 ml.
- Thuốc thử Dragendorff:
Dung dịch A: hòa tan 0,85 g bimuth nitrate base trong 40 ml nước cất và 10 ml acid acetic.
Dung dịch B: hòa tan 8 g KI trong nước.
Trộn lẫn dung dịch A va B theo thể tích bằng nhau. Cứ 10 ml hỗn hợp thêm
10 ml nước cất và 20 ml acid acetic.
Bảng 1. Tốc lan tơ (cm) của nấm vân chi đỏvà đen trên môi trường PGAY trong 2 ngày.
Vân chi đỏ Vân chi đen
Ngày 2 Ngày 3 Ngày 2 Ngày 3
1,00 2,10 0,80 2,10 1,00 2,10 0,70 2,05 1,00 2,00 1,20 2,20 0,95 2,20 1,10 2,10 1,00 2,05 0,90 2,00 1,00 2,00 0,80 2,10 0,85 2,00 0,80 2,10 1,00 2,20 0,80 2,10 0,90 2,00 0,90 2,15 0,90 2,10 1,90 2,00
1,00 2,05 1,00 2,00 1,10 2,20 0,80 2,00 0,80 2,10 1,20 2,00 0,90 2,05 0,80 2,15 0,80 2,10 0,80 2,10 0,94 ± 0,09 cm 2,08 ± 0,07 cm 0,89 ± 0,16 cm 2,06 ± 0,08 cm
Bảng 2. Đường kính (cm) vòng tan huyết của dịch chiết nấm vân chi đỏ và đen ở
các nồng độ khác nhau. Nồng độ Mẫu 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Vân chi đỏ 1,25 1,35 14,50 1,55 1,20 1,40 13,50 1,60 1,25 1,30 15,00 1,65 Trung bình 1,23 ± 0,03 1,35 ± 0,05 1,43 ± 0,08 1,60 ± 0,05 Vân chi đen 1,35 1,35 1,60 1,30 1,30 1,60 1,25 1,40 1,55 Trung bình 1,30 ± 0,05 1,35 ± 0,05 1,58 ± 0,03 Kết quả giải trình tự của công ty Macrogen (Hàn Quốc).
Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR từ cặp mồi ON1137 và ON1252 sau khi
được đọc trên phần mềm Chromas Pro1.6 5’- GCGGTTTTCCCCTTCCGGAAAAGGGTACCTGCGGAAGGATCATTAACGA GTTCTGAAAGGGGTTGTAGCTGGCCTTCCGGGGCATGTGCACACCCTGC TCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTAGGTTTGGCGTGGGCTTCGG GGCCTCCGGGCTCTGAGGCATTCTGCCGGCCTATGTATCACTACAAACA CATAAAGTAACAGAATGTATTCGCGTCTAACGCATCTAAATAC AACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGC GAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATC TTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGA GTGTCATGGAATTCTCAACCCACACGTCCTTGTGATGTTGCGGGCTTGGA TTTGGAGGCTTGCTGGCCCTCTGCGGTCGGCTCCTCTTGAATGCATTAGC TTGATTCCGTGCGGATCGGCTCTCAGTGTGATAATTGTCTACGCTGTGAC CGTGAAGCGTTTGGCGAGCTTCTAACCGTCCTGTATGGGACAACTTCTTG ACATCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATC AATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCCTAGTAACTGCGA GTGAAGCGGGAAAAGCTCAAATTTAAAATCTGGCGGTCTTTGGCCGTCC GAGTTGTAGTCTGGAGAAGTGCTTTCCGCGCTGGACCGTGTATAAGTCT CTTGGAACAGAGCGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTCTTTGACACGGAC TACCAGTGCTTTGTGATGCGCTCTCAAAGAGTCGCGTTGTTTGGGAATGC AGCGCAAAATGGGTGGTGAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAG ACCGATAGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACTTTGGA AAGAGAGTTAAACAGTACGTGAAATTGCTGAAAGGGAAACGCTTGAAG TCAGTCGCGTTGTCCGGGACTCAGCCTTGCTTCGGCTTGGTGCACTTTCC GGATGACGGGCCAGCATCGATTTTGACCGCTGGAAAAGGGCTGGAGGA ATGTGGCACCTTTTGGTGTGTTATAGCCTCCAGTCGCATACGGCGGTTGG GATCGAGGAACGCAGCACGCCTTACGGCGGGGGTTCGCCCACCTTCGTG CTTAGGATGCTGGCATAATGGCTTAAACGACCCGTCTTGAAACACGGAC
CAAGGAGTCTAACATGCCTGCGAGTGTTTGGGTGGAAAACCCGAGCGCG TAATGAAAGTGAAAGTCGGGACCTCTGTCGTGGAGGGCACCGACGCCC GGACCTGACGTTCTCTGACGGATCCGCGGTAGAGCATGTATGTTGGGAC CCGAAAGTGGTGAACTATGCCTGAATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTC TGGTGGAGGCTCGTAGCGATTCTGACTCAAATTCCTCTCTTATAAAATGT TGAGGGGGATATC-3’
Trong đó vùng gen mã hóa cho ITS1, 5.8S và ITS2 và một phần của LSU
5’- GCGGAAGGATCATTAACGAGTTCTGAAAGGGGTTGTAGCTGGCCTTCCG GGGCATGTGCACACCCTGCTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTA GGTTTGGCGTGGGCTTCGGGGCCTCCGGGCTCTGAGGCATTCTGCCGGC CTATGTATCACTACAAACACATAAAGTAACAGAATGTATTCGCGTCTAA CGCATCTAAATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGAT GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGT GAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGA GCATGCCTGTTTGAGTGTCATGGAATTCTCAACCCACACGTCCTTGTGAT GTTGCGGGCTTGGATTTGGAGGCTTGCTGGCCCTCTGCGGTCGGCTCCTC TTGAATGCATTAGCTTGATTCCGTGCGGATCGGCTCTCAGTGTGATAATT GTCTACGCTGTGACCGTGAAGCGTTTGGCGAGCTTCTAACCGTCCTGTAT GGGACAACTTCTTGACATCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTG AACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA-3’
Bảng 3. Trình tự rDNA của các loài nấm lấy từ GenBank.
Tên loài Chủng Mã số trên
GENBANK Mã số GI
Trametes sanguinea BRFM 1114 JX082366.1 395406725
Trametes hirsuta AB158313.1 58081982
Trametes versicolor BCRC3638 AY309019.1 32264086
Trametes ochracea AB158314.1 58081983
Ganoderma lucidum CSAAS0801 FJ940919.1 282160438
Grifola frondosa AFTOL-ID701 AY854084.1 57232718
Hericium erinaceus KUMC 1023 AY534601.1 43468943
Tricholoma matsutake TM4 AB036891.1 6906741
Hypsizygus marmoreus 1196 FJ609257.1 222354344
Pleurotus cystidiosus PSUMCC609 AY315792.1 37222374
Pleurotus floridanus CCRC 36038 AY265832.1 30039376
Pleurotus eryngii 6690 AY450347.1 38426284
Lentinula edodes 50624-ACCC AY683137.1 56384664
Flammulina velutipes AF036928.1 3169335
File: 1309ZAA058.ab1 Run Ended: 2012/8/25 1:15:44 Signal G:958 A:782 C:1039 T:825
File: 1309ZAA058.ab1 Run Ended: 2012/8/25 1:15:44 Signal G:958 A:782 C:1039 T:825
File: 1309ZAA059.ab1 Run Ended: 2012/8/25 1:15:44 Signal G:3397 A:3768 C:3943 T:2555
File: 1309ZAA059.ab1 Run Ended: 2012/8/25 1:15:44 Signal G:3397 A:3768 C:3943 T:2555
File: 1309ZAA060.ab1 Run Ended: 2012/8/25 1:15:44 Signal G:1572 A:1433 C:1388 T:1077
File: 1309ZAA060.ab1 Run Ended: 2012/8/25 1:15:44 Signal G:1572 A:1433 C:1388 T:1077