1. Tổng quan về bệnh cúm gia cầm
2.1.1. Điều tra tình hình dịch cúm gia cầm tại tỉnh Bắc Giang qua
2.1.2. Xác định hàm lượng kháng thể kháng virút cúm subtype H5 trong mẫu huyết thanh của gia cầm được tiêm phòng vắc xin cúm năm 2009 tại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
các địa phương trong tỉnh Bắc Giang.
2.1.3. Giám sát sự lưu hành của virút cúm năm 2009
2.2. Nguyên liệu
* Nguyên liệu chính
- Đối tượng kiểm tra: Gà, vịt đã được tiêm phòng vacxin cúm H5N1 trên địa bàn tỉnh Bắc Giang
- Vacxin: Vacxin vô hoạt subtype H5N1, chủng Re - 1 (A/Harbin/Re - 1/2003).
- Các hoá chất dùng trong xét nghiệm
* Môi trường và hoá chất bảo quản bệnh phẩm
- Môi trường Glycerol Pha chế PBS NaCl 8g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g Nước cất vđ 1000 ml
Hấp vô trùng 121oC/ 15 phút, bổ xung kháng sinh có trộn với glycerol
theo tỷ lệ 1:1.
* Chuẩn bị các dung dịch và xử lý huyết thanh - Dung dịch PBS 0,01M pH 7.2
Na2HPO4 1,096 g
NaH2PO4..H2O 0,316 g
Na Cl 8,5 g
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chỉnh pH = 7.2 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N, hấp vô trùng, bảo quản 4oC không quá 3 tuần.
- Dung dịch nước muối sinh lý 0,85%:
Pha 8,5 g NaCl trong 1000 ml nước cất. Hấp vô trùng, bảo quản 4oC không quá 3 tuần.
- Dung dịch hồng cầu gà 1%:
+ Máu gà trống khoẻ mạnh đã trưởng thành, không có kháng thể cúm và Newcastle.
+ Dùng bơm tiêm 5 - 10ml hút sẵn 1ml (10% thể tích) dung dịch chống đông (Natri Citrat 4%) rồi lấy máu gà cho máu vào ống nghiệm.
+ Ly tâm 1000 - 1500 vòng/phút, trong 15 phút, đổ bỏ huyết tương, cho thêm nước sinh lý (NaCl 0,85%) vào hồng cầu, lắc đều. Ly tâm như trên 3- 4 lần để rửa hồng cầu, sau lần ly tâm cuối hút bỏ nước ở trên.
+ Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1% bằng cách pha 1 ml hồng cầu với 99 ml nước muối sinh lý.
+ Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ 4 - 8oC. Hồng cầu sau khi
pha có thể dùng trong 4 - 5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết loại bỏ không dùng).
* Kháng huyết thanh chuẩn:
- Kháng huyết thanh chuẩn trên các loài như thỏ, dê, cừu... cần được xử lý bằng RDE (Receptor Destroying Enzyme) trước khi xét nghiệm.
- Kháng huyết thanh chế trên gà không cần xử lý bằng RDE. Tuy nhiên, nếu phản ứng cho kết quả không rõ ràng kháng huyết thanh có thể xử lý RDE để khẳng định kết quả là dương tính.
- Hoàn nguyên kháng huyết thanh và bảo quản ở nhiệt độ - 20oC, xử lý
kháng huyết thanh vô hoạt yếu tố ức chế đặc hiệu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trong nồi đun cách thuỷ qua đêm.
- Ủ tiếp ở nồi đun cách thuỷ nhiệt độ 56oC/30 phút để vô hoạt RDE
còn dư.
- Kháng huyết thanh đã xử lý để nguội cho thêm 6 phần nước sinh lý (0,3ml HT + 1,8ml SL), độ pha loãng cuối cùng của kháng huyết thanh là 1/10.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu
Đối tượng lấy mẫu là gà, vịt được tiêm vacxin H5N1 đang được nuôi tại tỉnh Bắc Giang
Nhổ hết lông tại vị trí lấy máu (mặt dưới cánh). Sát trùng bằng bằng bông cồn cho nổi rõ tĩnh mạch cánh. Dùng bơm tiêm loại 5ml, chọc kim vào tĩnh mạch theo chiều hướng đầu kim vào phía trong cơ thể gia cầm, lấy từ 2- 3ml máu/con, sau đó kéo dài pittong ra đến 5ml, bẻ gập đầu kim, đậy nắp kim lại, để nghiêng (lấy được nhiều huyết thanh) cho máu đông tự nhiên.
Mẫu huyết thanh có thể để ở nhiệt độ 4oC (bảo quản trong hộp xốp đựng đá) nếu dùng ngay trong vòng 48 giờ, nếu bảo quản lâu hơn, giữ ở nhiệt độ - 70oC (tủ lạnh có độ âm sâu).
Mẫu huyết thanh được vận chuyển tới phòng xét nghiệm của Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương trong điều kiện lạnh (phích đá) càng sớm càng tốt, có phiếu gửi bệnh phẩm kèm theo.
2.3.2. Thực hiện phản ứng HI
Tiến hành phản ứng HI gồm các bước:
* Phản ứng ngưng kết hồng cầu HA a. Nguyên lý của phản ứng
Trên bề mặt của virus cúm có kháng nguyên Hemagglutinin có tác dụng gắn kết các hồng cầu lại với nhau và ta có thể quan sát hiện tượng này
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
bằng mắt thường.
b. Ứng dụng
- Chuẩn độ kháng nguyên chuẩn.
- Chuẩn độ kháng nguyên (Virus) phân lập từ bệnh phẩm. - Tính 4HA để dùng cho phản ứng HI.
c. Nguyên liệu
- Mẫu kiểm tra: Nước trứng hoặc kháng nguyên chuẩn
- Hồng cầu: hỗn dịch hồng cầu 1% được pha với dung dịch Asever hoặc nước muối sinh lý. Các loại hồng cầu có thể sử dụng: Hồng cầu gà, gà tây. Có thể dùng hồng cầu người type O, hồng cầu chuột lang 0.75% hoặc hồng cầu ngựa 1%.
- Nước cất vô trùng. - Nước muối sinh lý.
- Dung dich phosphate buffer saline (PBS) 0.01M pH 7.2.
d. Cách tiến hành phản ứng
- Nhỏ 25µl PBS 0.01M vào đĩa 96 giếng chữ V(đĩa TaKaShi) từ giếng 1 đến giếng 12 của mỗi hàng.
- Nhỏ 25µl kháng nguyên chuẩn hoặc kháng nguyên phân lập vào các giếng A1 - H1.
- Pha loãng mẫu kháng nguyên kiểm tra theo cơ số 2 bằng cách chuyển 25µl kháng nguyên từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng thứ 11, rồi bỏ đi 25µl cuối cùng.
- Nhỏ 25µl PBS 0.01M vào các giếng.
- Nhỏ 25µl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng trên. - Lắc đĩa bằng máy hoặc bằng tay.
- Ủ ở nhiệt độ phòng 200C trong 30 - 40 phút. - Đọc kết quả:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy giếng.
Hiệu giá HA của virus được tính ở độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ngưng kết hồng cầu. (Bộ Nông nghiệp và PTNT (2004)[3]
Ví dụ: Nếu ở độ pha loãng 1/127 còn có ngưng kết thì hiệu giá HA là 1/127.
Vì HA = 1/127 nên 4HA = 32.
2.3.3. Giám định virus bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI
Theo Bộ Nông nghiệp và PTNT (2004) [4], cách tiến hành phản ứng HI như sau:
* Nguyên lý:
Virus cúm gia cầm có đặc tính gây ngưng kết hồng cấu một số loài gia súc, gia cầm. Nếu gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng thì virus bị kháng thể đặc hiệu trung hoà, không còn virus để tiếp xúc với hồng cầu hay nói cách khác kháng thể đã ngăn trở sự ngưng kết hồng cầu của virus. Còn nếu virus không gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng, virus sẽ không bị trung hoà và virus sẽ làm hồng cầu ngưng kết lai với nhau.
* Chuẩn bị kháng nguyên
- Chuẩn bị kháng nguyên: Là kháng nguyên của virus cúm, loại serotyp virus cúm cần cho yêu cầu kiểm tra.
- Kháng nguyên được chuẩn độ bằng phản ứng HA.
- Pha kháng nguyên 4HA/25µl: Lấy độ pha loãng cuối cùng có phản ứng ngưng kết hồng cầu chia cho 4.
Ví dụ: Hiệu giá HA của kháng nguyên (dịch niệu mô) là 1/127 Đơn vị 4 HA = 127: 4 = 32
Như vậy sẽ trộn 1 phần kháng nguyên (nước trứng) với 31 phần PBS để đạt được dung dịch kháng nguyên 4 HA.
- Chuẩn độ kháng nguyên 4 HA:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tiến hành:
+ Cho 25µl PBS vào giếng A1 - C6.
+ Cho 25µl kháng nguyên đã pha vào các lỗ A1 đến C1.
+ Pha loãng kháng nguyên từ cột 1 đến cột 5, sau đó bỏ đi 25µl. + Đối chứng ở cột 6 (gồm PBS và hồng cầu).
+ Cho 25µl PBS vào các lỗ của đĩa (từ A1 - C6).
+ Cho 25µl hồng cầu gà 1% vào các lỗ của đĩa (từ A1 - C6).
+ Lắc đều ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đọc kết quả khi hồng cầu ở cột đối chứng lắng hoàn toàn.
Đọc kết quả:
+ Pha chuẩn: Kết quả ngưng kết xảy ra ở 2 giếng đầu. + Pha không chuẩn:
Kháng nguyên đặc: Nếu ngưng kết đền giếng thứ 3 là thừa kháng nguyên. Như vậy, kháng nguyên HA phải được pha loãng (có thể gấp đôi) để có ngưng kết ở giếng thứ 2.
Kháng nguyên loãng: Nếu ngưng kết ở giếng thứ 1 tức là thiếu kháng nguyên, có thể thêm một lượng kháng nguyên (bằng lượng kháng nguyên pha ban đầu) để có ngưng kết ở giếng thứ 2.
* Tiến hành phản ứng HI
Dùng đĩa ngưng kết 96 lỗ chữ V. Ghi mẫu huyết thanh cần kiểm tra và subtyp virus đưa vào phản ứng lên đĩa ngưng kết.
- Cho 25µl PBS vào tất cả các lỗ trên đĩa.
- Cho 25µl huyết thanh kiểm tra vào các lỗ từ A1 - H1 (cột 1).
Pha loãng huyết thanh: Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 bằng cách lấy 25µl huyết thanh từ cột 1 chuyển sang cột 2 trộn đều với PBS của lỗ, sau đó lại chuyển 25µl từ cột 2 sang cột 3 cứ làm như vậy huyết thanh được pha loãng đến cột 11 thì hút bỏ đi 25µl huyết thanh. Cột 12 dùng làm đối chứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Nhỏ 25µl kháng nguyên 4HA đã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1 đến 11. Thêm 25µl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12).
- Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Nhỏ 25µl dung dịch hồng cầu gà (1%) vào tất cả các giếng trong đĩa, lắc đều. Để ở nhiệt độ phòng 40 phút. Đọc kết quả.
Đọc kết quả:
Phản ứng âm tính (-): Nếu không có hiện tượng ngưng kết xảy ra ở giếng phản ứng.
Phản ứng dương tính (+): Nếu hồng cầu nắng xuống đáy giếng chữ V. Hiệu giá HI của mẫu được tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Tức là, virus phân lập và kháng huyết thanh chuẩn tương ứng với nhau
Theo quy định số 1361/KTY-DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn [4 ]: Ngưỡng bảo hộ hiệu giá (HI) =4log2
Kháng thể cao hiệu giá ≥ 4log2 Không được bảo hộ hiệu giá ≤ 4log2 * Chú ý:
- Khi kiểm tra huyết thanh các loài khác không phải là gà, chim cút nên có một giếng chỉ có huyết thanh và hồng cầu để kiểm tra hiện tượng ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu. Nếu có hiện tượng ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu thì hiện tượng xảy ra với mẫu huyết thanh nào thì mẫu huyết thanh đó cần xử lý và kiểm tra lại bằng phản ứng HI.
- Xác định subtype: Một virút phân lập được xác định subtype khi nó
phản ứng với một kháng huyết thanh chuẩn hiệu giá cao hơn 4 lần so với kháng huyết thanh chuẩn khác. Hiệu giá càng cao chứng tỏ sự tương đồng của virút phân lập với kháng nguyên chuẩn càng lớn.
2.3.4.Phản ứng Real time RT - PCR (Xem phụ lục)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Cách tính hiệu giá kháng thể: Hiệu giá HI của mẫu được tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu hoàn toàn. Độ pha loãng huyết thanh theo cơ số 2, tức là lần 1 là 1/2 tương ứng với (1log2), lần 2 là 1/4 tương ứng với 2log2, lần 3 là 1/8 tương ứng với 3log2, lần 4 là 1/16 tương ứng với 4 log2….
Mẫu huyết thanh gà sau khi tiêm vắc xin cúm gia cầm có HGKT(Hiệu giá kháng thể) ≥ 16(tức là 4 log2) được coi là đạt mức bảo hộ. Mẫu huyết thanh vịt được coi là đạt mức bảo hộ khi HGKT ≥ 20(4,3 log2)
- Công thức tính tỉ lệ bảo hộ cá thể/đàn của vắc xin:
Tỉ lệ bảo hộ =
Số mẫu đạt HGKT bảo hộ Tổng số mẫu
- Nếu một đàn có tỉ lệ bảo hộ ≥ 70% thì được coi là bảo hộ đàn.
Số liệu được xử lý theo phương pháp toán học thông dụng và thống kê sinh học (chương trình Microsoft Excel).
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tình hình chăn nuôi gia cầm và sử dụng vắc xin cúm gia cầm tại Bắc Giang Bắc Giang
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Để đánh giá thiệt hại của dịch cúm gia cầm đối với ngành chăn nuôi gia cầm tại tỉnh Bắc Giang, chúng tôi đã tiến hành thống kê các số liệu về tình hình chăn nuôi gia cầm của tỉnh trước và sau khi có dịch cúm. Số liệu được trình bày qua bảng 4.1.
Bảng 3.1. Tình hình chăn nuôi gia cầm tại Bắc Giang một số năm gần đây
Năm Số lƣợng gia cầm (1000 con) Tỷ lệ tăng đàn (%) Sản lƣợng thịt (tấn) Tỷ lệ tăng (%) Sản lƣợng trứng (quả) Tỷ lệ tăng (%) 2001 7.564 6,9 9.751 - 55.715 - 2002 8.102 7,1 10.206 4,7 57.270 2,8 2003 9.962 19,3 10.779 5,6 68.896 20,3 2004 8.257 -14,5 11.156 3,5 61,058 3,5 2005 9.075 9,9 12.166 9,1 79.025 7,1 2006 10.270 13,3 13.880 11,0 79.850 7,45 2007 10.979 6,8 15.579 15,4 79.064 7,47 2008 12.067 6,9 15.890 15,7 80.274 7,5 2009 14.338 7,3 16.100 16,5 80.769 7,8
(Nguồn: Cơ sở dữ liệu thống kê - Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn tính đến tháng 12/2009)
Qua số liệu bảng 3.1 có thể thấy:
- Giai đoạn trước khi có dịch cúm gia cầm (2001-2003), ngành chăn nuôi gia cầm phát triển khá ổn định với mức tăng bình quân đạt khoảng 7%. Thậm chí năm 2003 mức tăng đàn đạt 19,3% so với năm 2002.
Cùng với sự tăng về số lượng gia cầm, sản lượng thịt và trứng cũng có mức tăng trưởng hàng năm đáng kể. Sản lượng thịt tăng khoảng 5% mỗi năm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sản lượng trứng cũng tăng mức trên 2,8%. Trong năm 2003 cùng với mức tăng đàn, sản lượng trứng cũng tăng 20,3%.
Tuy nhiên, khi dịch cúm gia cầm lần đầu tiên xuất hiện vào cuối năm 2003, do tính chất bất ngờ của dịch nên thiệt hại đối với ngành chăn nuôi là rất lớn. Số lượng đàn gia cầm năm 2004 đã giảm tới 14,5% so với năm 2003 (giảm hơn 14 triệu con gia cầm).
- Năm 2005 có sự phục hồi của ngành chăn nuôi gia cầm sau 2 năm dịch liên tiếp sảy ra, tổng đàn gia cầm tăng 9,9%. Tuy nhiên so với năm 2004 vẫn chưa đạt được số lượng, chất lượng như trước khi dịch sảy ra. Sản lượng trứng tăng hơn 7% và sản lượng thịt tăng hơn 9%.
- Trong các năm từ 2005 -2007, dịch cúm vẫn liên tiếp tái phát trên địa bàn tỉnh Bắc Giang (có 03 đợt dịch). Do thực hiện đồng bộ các biện pháp chống dịch (như sử dụng vắc xin tiêm phòng, phát hiện dịch sớm, khoanh vùng cách ly, tiêu độc khử trùng triệt để...nên hầu hết các ổ dịch đề được khống chế, giảm thiệt hại về kinh tế. Vì vậy năm 2006 tỷ lệ tăng đàn vẫn đạt 13,3%, số lượng gia cầm khoảng 10,3 triệu con, cao hơn thời điểm chưa có dịch. Sản lượng thịt và trứng đều tăng đáng kể.
Từ năm 2008-2009 nhìn một cách tổng thể, không xuất hiện dịch cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang. Mức độ tăng trưởng của ngành chăn nuôi thể hiện qua sự tăng đàn, sản lượng thịt, trứng vẫn duy trì và tăng trưởng đều so với năm 2006.
Qua các nhận xét trên, có thể đánh giá thiệt hại do dịch cúm gia cầm gây ra đối với ngành chăn nuôi gia cầm của tỉnh Bắc Giang trong những năm đầu dịch mới xuất hiện là khá nghiêm trọng. Tổng đàn gia cầm đã sụt giảm rõ rệt về số lượng, chất lượng và phái mất từ 2-3 năm sau mới có thể phục hồi,