1. Tổng quan về bệnh cúm gia cầm
2.3.3. Giám định virus bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng
Theo Bộ Nông nghiệp và PTNT (2004) [4], cách tiến hành phản ứng HI như sau:
* Nguyên lý:
Virus cúm gia cầm có đặc tính gây ngưng kết hồng cấu một số loài gia súc, gia cầm. Nếu gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng thì virus bị kháng thể đặc hiệu trung hoà, không còn virus để tiếp xúc với hồng cầu hay nói cách khác kháng thể đã ngăn trở sự ngưng kết hồng cầu của virus. Còn nếu virus không gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng, virus sẽ không bị trung hoà và virus sẽ làm hồng cầu ngưng kết lai với nhau.
* Chuẩn bị kháng nguyên
- Chuẩn bị kháng nguyên: Là kháng nguyên của virus cúm, loại serotyp virus cúm cần cho yêu cầu kiểm tra.
- Kháng nguyên được chuẩn độ bằng phản ứng HA.
- Pha kháng nguyên 4HA/25µl: Lấy độ pha loãng cuối cùng có phản ứng ngưng kết hồng cầu chia cho 4.
Ví dụ: Hiệu giá HA của kháng nguyên (dịch niệu mô) là 1/127 Đơn vị 4 HA = 127: 4 = 32
Như vậy sẽ trộn 1 phần kháng nguyên (nước trứng) với 31 phần PBS để đạt được dung dịch kháng nguyên 4 HA.
- Chuẩn độ kháng nguyên 4 HA:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tiến hành:
+ Cho 25µl PBS vào giếng A1 - C6.
+ Cho 25µl kháng nguyên đã pha vào các lỗ A1 đến C1.
+ Pha loãng kháng nguyên từ cột 1 đến cột 5, sau đó bỏ đi 25µl. + Đối chứng ở cột 6 (gồm PBS và hồng cầu).
+ Cho 25µl PBS vào các lỗ của đĩa (từ A1 - C6).
+ Cho 25µl hồng cầu gà 1% vào các lỗ của đĩa (từ A1 - C6).
+ Lắc đều ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đọc kết quả khi hồng cầu ở cột đối chứng lắng hoàn toàn.
Đọc kết quả:
+ Pha chuẩn: Kết quả ngưng kết xảy ra ở 2 giếng đầu. + Pha không chuẩn:
Kháng nguyên đặc: Nếu ngưng kết đền giếng thứ 3 là thừa kháng nguyên. Như vậy, kháng nguyên HA phải được pha loãng (có thể gấp đôi) để có ngưng kết ở giếng thứ 2.
Kháng nguyên loãng: Nếu ngưng kết ở giếng thứ 1 tức là thiếu kháng nguyên, có thể thêm một lượng kháng nguyên (bằng lượng kháng nguyên pha ban đầu) để có ngưng kết ở giếng thứ 2.
* Tiến hành phản ứng HI
Dùng đĩa ngưng kết 96 lỗ chữ V. Ghi mẫu huyết thanh cần kiểm tra và subtyp virus đưa vào phản ứng lên đĩa ngưng kết.
- Cho 25µl PBS vào tất cả các lỗ trên đĩa.
- Cho 25µl huyết thanh kiểm tra vào các lỗ từ A1 - H1 (cột 1).
Pha loãng huyết thanh: Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 bằng cách lấy 25µl huyết thanh từ cột 1 chuyển sang cột 2 trộn đều với PBS của lỗ, sau đó lại chuyển 25µl từ cột 2 sang cột 3 cứ làm như vậy huyết thanh được pha loãng đến cột 11 thì hút bỏ đi 25µl huyết thanh. Cột 12 dùng làm đối chứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Nhỏ 25µl kháng nguyên 4HA đã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1 đến 11. Thêm 25µl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12).
- Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Nhỏ 25µl dung dịch hồng cầu gà (1%) vào tất cả các giếng trong đĩa, lắc đều. Để ở nhiệt độ phòng 40 phút. Đọc kết quả.
Đọc kết quả:
Phản ứng âm tính (-): Nếu không có hiện tượng ngưng kết xảy ra ở giếng phản ứng.
Phản ứng dương tính (+): Nếu hồng cầu nắng xuống đáy giếng chữ V. Hiệu giá HI của mẫu được tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Tức là, virus phân lập và kháng huyết thanh chuẩn tương ứng với nhau
Theo quy định số 1361/KTY-DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn [4 ]: Ngưỡng bảo hộ hiệu giá (HI) =4log2
Kháng thể cao hiệu giá ≥ 4log2 Không được bảo hộ hiệu giá ≤ 4log2 * Chú ý:
- Khi kiểm tra huyết thanh các loài khác không phải là gà, chim cút nên có một giếng chỉ có huyết thanh và hồng cầu để kiểm tra hiện tượng ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu. Nếu có hiện tượng ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu thì hiện tượng xảy ra với mẫu huyết thanh nào thì mẫu huyết thanh đó cần xử lý và kiểm tra lại bằng phản ứng HI.
- Xác định subtype: Một virút phân lập được xác định subtype khi nó
phản ứng với một kháng huyết thanh chuẩn hiệu giá cao hơn 4 lần so với kháng huyết thanh chuẩn khác. Hiệu giá càng cao chứng tỏ sự tương đồng của virút phân lập với kháng nguyên chuẩn càng lớn.