1.4.3.1. Một số nghiờn cứu nước ngoài:
Hàng trăm cụng trỡnh nghiờn cứu đó được tiến hành (in vitro, in vivo, trờn lõm sàng) đó cho thấy NLC là một dược liệu đa cụng dụng [8], [40], [116]; cụ thể như:
- Nấm Linh chi cú tỏc dụng tăng cường miễn dịch, tăng sức đề khỏng của bệnh nhõn [58], [66], [96], [112], [124].
- Nấm Linh chi cú tỏc dụng hỗ trợ sự ức chế phỏt triển của tế bào ung thư: ức chế sự phỏt triển của tế bào ung thư Sarcom 180 [59], [63], [69], [77], [86], [121]; tỏc dụng trờn tế bào ung thư đại tràng [80], trờn tế
bào ung thư tiền liệt tuyến [91], trờn sự phỏt triển của tế bào ung thư vỳ (Jiang và CS) [90]. Sau uống nấm Linh chi hoặc nấm Linh chi bào tử: ăn uống và giấc ngủ được cải thiện, tuổi thọ kộo dài [97].
- Nấm Linh chi cú tỏc dụng chống lóo hoỏ: dịch chiết NLC bảo vệ tế bào tim khỏi cỏc tổn thương do oxy hoỏ gõy ra [5], tỏc dụng chống oxy hoỏ lipid và chống gốc tự do của dịch chiết thụ nấm Linh chi [43], [51], [108], [117],[131].
- Nấm Linh chi trong điều trị rối loạn lipid mỏu:
+ Năm 1989,1991: cụng trỡnh nghiờn cứu của KiNo (Nhật Bản) đó chứng minh trong nấm Linh chi cú nhúm hoạt chất steroid và triterpen cú tỏc dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol mỏu [40].
+ Cỏc cụng trỡnh nghiờn cứu vế nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) trờn in vitro và exvivo đó chứng minh trong loại nấm này của Trung Quốc cú nhúm sterol cú tỏc dụng điều trị rối loạn lipid mỏu [92].
+ Theo nghiờn cứu của Viện Hàn lõm khoa học - Trung Quốc cho thấy: nấm Linh chi làm giảm cholesterol toàn phần, làm tăng nhúm lipoprotein tỉ
trọng cao (HDL-C) trong mỏu [39], [40], [41].
- Ngoài ra cỏc nghiờn cứu cũn cho thấy: Linh chi cú tỏc dụng trong trị
bệnh mạch vành tim, cú cụng dụng hạ huyết ỏp, điều trị suy nhược thần kinh [41]; bảo vệ gan và điều trị bệnh viờm gan,... [41].
1.4.3.2. Nghiờn cứu trong nước:
Cỏc cụng trỡnh nghiờn cứu trong nước đó cho thấy: nấm Linh chi Việt Nam cú tỏc dụng tăng cường miễn dịch trong ung thư [11], làm giảm cholesterol mỏu [2], [25]; bảo vệ gan, ngăn cản rừ rệt tỏc dụng làm tăng AST và ALT [25], [26]; chống oxy hoỏ, tăng lực và hồi phục khả năng học tập - nhận thức, ghi nhớ bị gõy suy giảm bởi scopolamin [9], [25].
1.4.4. Tổng quan về nấm Linh chi Đà Lạt:
* Theo những nghiờn cứu của Trần Văn Móo, Trịnh Tam Kiệt, Đàm Nhận, Phạm Quang Thu, Lờ Xuõn Thỏm ... đó phỏt hiện được 46 loài Linh chi
ở lónh thổ nước ta, Ganoderma cú 46 loài đó được nghiờn cứu trong đú cú 4 loài chuẩn và 4 chủng đú là [9], [32], [40]: chủng nấm Lim (Li) ở Hà Bắc – Vị đắng và nếu uống nhiều dễ say (cú thể cú độc vỡ mọc trờn cõy Lim Erythrophloeum fordii). Chủng nấm Linh chi Đà Lạt (DL) – Vị rất đắng. Mới
đõy đó phỏt hiện thờm 1 chủng đặc biệt ở Đồng Thỏp Mười, Mộc Húa, Long An - là chủng đầu tiờn thu được ở vựng Nam bộ với sắc thỏi vàng tươi ở mặt trờn tỏn, cú thể gọi là Hoàng chi [40]. Chủng Linh chi Sài Gũn với sắc thỏi nõu đỏ sẫm trong tự nhiờn và hầu như khụng đắng [40]. Chiếm ưu thế và thường gặp nhất là nấm Ganoderma lucidum (Lyess. ex Fr.) Karst [40].
* Thành phần húa học của nấm Linh chi: Tổng kết từ những nghiờn cứu trước đõy, thành phần hoỏ học của loài Ganoderma lucidum và một số
loài khỏc trong chi Ganoderma cú thành phần chớnh như sau [40], [41], [99], [100]: nước, lignin, hợp chất nitơ, hợp chất phenol, chất bộo, hợp chất steroid, chất khử, cellose. Ngoài ra nấm Linh chi cũn chứa cỏc nguyờn tố vụ cơ: Ag, Br, Ca, Fe, K, Na, Mg, Mn, Sn, Zn, Bi. Cho đến nay theo thống kờ của một số
tỏc giả thỡ đó phỏt hiện và chứng minh cấu trỳc hoỏ học của hàng trăm chất cú trong G.Lucidum. Trong đú đỏng kể nhất là cỏc nhúm chất Tepenoids, Acid amin, Alcaloid, Polysaccharid [8].
Với việc ỏp dụng cỏc kỹ thuật phõn tớch hạt nhõn hàng loạt mẫu nấm Linh chi nuụi trồng ở Việt Nam đó cho thấy cú 31 nguyờn tố vi lượng và đa lượng [41], [99], [100]. Trong cỏc chủng Linh chi (Ganoderma lucidum) cú cỏc nguyờn tố đa lượng cần thiết cho cơ thể như: N, P, K, Ca, Mg, nhưng hai nguyờn tố quan trọng nhất được cho là selenium và germanium [99], [100].
- Tại Đà Lạt đó nuụi trồng được 4 loại nấm Linh chi [39]. Cụ thể: nấm Hồng chi - thuộc Xớch chi (xem hỡnh 6 và hỡnh 7 phụ lục 1), nấm Linh chi sũ (Ganoderma eapence) Lloyd Teng, nấm Hoàng chi G.SP, nấm Hắc chi.
Trong đú nấm Hồng chi [Ganoderma lucidum (w. Curt:Fr.) Karst.] chủng DL1 được trồng nhiều hơn và cú năng suất cao hơn [40].
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. CHẤT LIỆU NGHIấN CỨU
Nấm Hồng chi Đà Lạt (Ganoderma lucidum W.Curt:Fr. Karst.) chủng DL1 do trung tõm giống cõy thuốc tại Đà Lạt cung cấp; được nấu thành cao lỏng (1:1) và dập thành viờn nang 1g/viờn tại Cụng ty cổ phần Dược vật tư Y tế Lõm Đồng.
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ bào chế
Cao lỏng Cao đặc (đạt tiờu chuẩn cơ sở ) Cao khụ Cốm Nấm Hồng chi (đạt tiờu chuẩn cơ sở) Dịch chiết toàn phần Rửa sạch, ủ mềm, thỏi phiến, xay thành bột thụ Bột thụ Bó dược liệu Dịch chiết 1 + H2O, đun ở nhiệt độ 1000c/3-4h, chiết lấy dịch Bã d−ợc liệu Dịch chiết 2 Bó dược liệu Dịch chiết 2 H2O+ Bó dược liệu Dịch chiết 3 H2O+ Cụ ở nhiệt độ 70-800c Cụ ở nhiệt độ 50- 600c ỏp suất giảm Cụ chõn khụng + tỏ dược, sỏt hạt + vỏ nang Viờn thuốc (viờnnang)
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIấN CỨU 2.2.1.Nghiờn cứu trờn động vật:
- Chuột nhắt trắng (Musmusculus) chủng Swiss, thuần chủng, cả 2 giống, khoẻ mạnh, cú trọng lượng từ 20 ± 2 gam để nghiờn cứu xỏc định
độc tớnh cấp (LD50) của nấm Hồng chi Đà Lạt.
- Thỏ chủng Orytolagus Cuniculus, cả hai giống khoẻ mạnh, nặng 1,8 - 2,5 kg do Trung tõm nghiờn cứu dờ và thỏ Sơn tõy cung cấp để nghiờn cứu
độc tớnh bỏn trường diễn của nấm Hồng chi.
- Chuột cống trắng Ratus musculus, cả hai giống, khoẻ mạnh trọng lượng 130 ± 30g để nghiờn cứu tỏc dụng của nấm Hồng chi trờn mụ hỡnh tăng cholesterol mỏu thực nghiệm.
Động vật được nuụi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại phũng thớ nghiệm của Bộ mụn Dược lý Trường đại học Y Hà nội từ 3 - 7 ngày trước khi nghiờn cứu và trong suốt thời gian nghiờn cứu.
2.2.2. Nghiờn cứu trờn người:
Người cú hội chứng rối loạn lipid mỏu được tiến hành thử nghiệm lõm sàng.
* Cỡ mẫu: Cụng thức được sử dụng để đỏnh giỏ sự thay đổi hàm lượng cholesterol trước và sau điều trị:
n: cỡ mẫu tối thiểu
σ: độ lệch chuẩn từ nghiờn cứu thử nghiệm = 0,55 z 1-α/2 = 1,96
z 1-β= 0,842
μ1: hàm lượng cholesterol trước điều trị = 6,16 (Từ nghiờn cứu thử
μ2: hàm lượng cholesterol sau điều trị = 5,70 (Từ nghiờn cứu thử
nghiệm trờn 10 bệnh nhõn).
ệ n = 31
Việc phõn nhúm nghiờn cứu: dựa vào hàm lượng cholesterol mỏu, chọn bệnh nhõn cựng giới, chờnh lệch về tuổi là ± 5 tuổi (đối chiếu cặp)
* Tiờu chuẩn chọn bệnh nhõn:
- Bệnh nhõn cả hai giới (nam và nữ); điều trị nội trỳ tại Bệnh viện YHCT Phạm Ngọc Thạch - Lõm Đồng, Bệnh viện Đa khoa YHCT - Hà Nội:
+ Chưa từng được điều trị bằng một thuốc RLLPM nào hoặc nếu được
điều trị rồi thỡ cũng đó ngừng cỏc thuốc đú ớt nhất 3 thỏng, khụng dựng cỏc thuốc cú thể gõy RLLPM.
+ Khụng phõn biệt giới tớnh, nghề nghiệp. + Tuổi > 30
+ Tự nguyện tham gia nghiờn cứu này.
- Chọn bệnh nhõn theo YHHĐ: Bệnh nhõn cú hội chứng RLLPM thoả
món cỏc điều kiện sau [47], [102]:
+ CT ≥ 6,5 mmol/l, LDL-C ≥ 4,2 mmol/l + Hoặc TG > 2,3 mmol/l
+ Hoặc CT từ 5,2 - 6,5 mmol/l, HDL-C < 0,91 mmol/l.
Cỏc bệnh nhõn được tuyển chọn nghiờn cứu cú số đo huyết ỏp tõm thu là 110 - 139 mmHg, huyết ỏp tõm trương 70 - 89 mmHg (thuộc giai đoạn tiền tăng huyết ỏp theo JNC VII, thỏng 6 năm 2003).
- Chọn bệnh nhõn theo YHCT: Dựa vào tứ chẩn: bệnh nhõn cú cỏc biểu hiện sau:
+ Vọng chẩn: rờu lưỡi trắng nhờn, nhớt; chất lưỡi bệu, cú vết hằn răng. + Văn chẩn: nếu thiờn về thực chứng: núi to, thở mạnh, hơi thở hụi. Nếu thiờn về hư chứng: núi nhỏ, thở yếu, hơi thở khụng hụi.
+ Vấn chẩn: chúng mặt, tức ngực, dị cảm, ớt ngủ, mệt mỏi, thõn mỡnh cú cảm giỏc nặng nề, chậm tiờu, bụng đầy trướng; hoa mắt, đau đầu, miệng khụ, khỏt khụng muốn uống, mệt mỏi, tứ chi ró rời, cơ nhục nhẽo, ăn kộm, đau lưng, mỏi gối, ự tai.
+ Thiết chẩn: mạch hoạt hoặc huyền hoạt.
* Tiờu chuẩn loại trừ: (theo YHHĐ)
Những bệnh nhõn khụng được nhận vào diện nghiờn cứu:
- Cú hội chứng RLLPM thứ phỏt sau cỏc bệnh: thiểu năng giỏp, đỏi thỏo đường, hội chứng thận hư, suy gan, suy thận.
- Cỏc bệnh nhõn rối loạn tiờu hoỏ kộo dài, ảnh hưởng tới hấp thu và chuyển húa thuốc, phụ nữ cú thai, phụ nữ đang cho con bỳ, người bị suy dinh dưỡng, người bị bệnh tõm thần, người đang sử dụng thuốc ảnh hưởng đến chuyển hoỏ lipid.
- Bệnh nhõn mắc cỏc bệnh nhiễm khuẩn, bệnh cấp tớnh kốm theo. - Bệnh nhõn nghiờn cứu nhưng khụng chấp hành đỳng theo tiờu chuẩn nghiờn cứu (khụng trở lại khỏm định kỳ, khụng uống thuốc đỳng quy định, dựng thờm thuốc khỏc).
- Cỏc bệnh nhõn được lựa chọn nghiờn cứu đó và đang thực hiện chế độ ăn kiờng theo hướng dẫn (phụ lục 3) và ngừng thuốc điều trị rối loạn lipid mỏu khỏc ớt nhất 3 thỏng.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.3.1. Xỏc định thành phần hoỏ học của nấm Hồng chi Đà Lạt
(Ganoderma lucidum) chủng DL1:
Cỏc thớ nghiệm được tiến hành tại Bộ mụn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội năm 2006, bằng phương phỏp hoỏ học cõy thuốc [17].
Cõn 100g nấm Hồng chi Đà Lạt đó sấy khụ và xay nhỏ, chiết nhiều lần bằng 150 - 250 ml ether. Kiềm húa dung dịch ether bằng dung dịch KOH 10%. Gạn bằng bỡnh gạn được dung dịch kiềm và lớp ether. Acid húa dung dịch kiềm
bằng HCl. Lọc lấy tủa, hũa tan tủa đú bằng cồn 900. Tiến hành cỏc phản ứng húa học sơ bộ định tớnh một số nhúm cỏc hợp chất sau : + Nhúm chất anthraglycosid + Nhúm chất flavonoid + Nhúm chất alcaloid + Nhúm sterol + Nhúm polysaccharid. + Nhúm saponin + Nhúm acid amin + Nhúm glycosid tim + Nhúm coumarin
2.3.2. Nghiờn cứu tớnh an toàn của nấm Hồng chi:
Tiến hành tại bộ mụn Dược lớ - Trường Đại học Y Hà Nội, năm 2007.
* Độc tớnh cấp (Theo phương phỏp Litchfiel – Wilcoxon): Chuột nhắt trắng nhịn đúi 12 giờ được chia thành 9 lụ khỏc nhau, mỗi lụ 10 con. Chuột được uống cao lỏng nấm Hồng chi Đà Lạt (Ganoderma lucidum
W.Curt:Fr. Karst.) do Cụng ty cổ phần Dược vật tư Y tế Lõm Đồng cung cấp với nồng độ tăng dần trong cựng một khối lượng 0,2ml/10g thõn trọng
để xỏc định liều thấp nhất gõy chết 100% và liều cao nhất gõy chết 0%. Chuột được theo dừi tỡnh trạng chung trong suốt 07 ngày và tỉ lệ chết trong 72 giờ của từng lụ sau khi uống thuốc. Nếu chuột chết, được mổ để
quan sỏt đại thể.
* Độc tớnh bỏn trường diễn:
- Thỏ thớ nghiệm được chia thành 3 lụ, mỗi lụ 10 con:
+ Lụ 2: uống cao lỏng nấm Hồng chi Đà Lạt với liều 2g/kg/24giờ liờn tục trong 30 ngày.
+ Lụ 3: uống cao lỏng nấm Hồng chi Đà Lạt với liều 10g/kg/24giờ liờn tục trong 30 ngày (tương đương với liều cho người và gấp 5 lần liều thường dựng cho người).
Trong suốt 30 ngày thớ nghiệm, chỳng tụi tiến hành: theo dừi tỡnh trạng chung của thỏ (cõn nặng và diễn biến hoạt động hàng ngày).
- Trước lỳc uống thuốc, sau 15 ngày và 30 ngày uống thuốc thỏ được cõn và lấy mỏu đỏnh giỏ:
+ Chức phận tạo mỏu qua: số lượng hồng cầu, bạch cầu, cụng thức bạch cầu, định lượng huyết sắc tố, định lượng hematocrit.
+ Chức năng gan: định lượng hoạt độ transaminase trong huyết thanh. + Chức năng thận qua: định lượng creatinin, ure huyết thanh.
- Mụ bệnh học: cuối đợt thớ nghiệm (sau 30 ngày) 2/3 số thỏ của mỗi lụ
được giết; cũn 1/3 số thỏ của mỗi lụ được giữ lại nuụi tiếp trong 15 ngày, sau
đú mới giết thỏ đểđỏnh giỏ:
+ Hỡnh ảnh đại thể của gan, tuỵ, lỏch, thận sau 30 ngày uống thuốc bằng kớnh lỳp.
+ Hỡnh ảnh vi thể: sau khi quan sỏt, đỏnh giỏ hỡnh ảnh đại thể. Cỏc phủ
tạng gan và thận được cố định bằng formol, đỳc chuyển qua cỏc dung dịch để
loại nước, rồi đỳc trong khối parafin, cắt lỏt dày 5 - 6 àm. Nhuộm tiờu bản bằng phương phỏp Hematoxylin - Eosin. Đọc tiờu bản bằng kớnh hiển vi quang học với độ phúng đại 100 - 400 lần. Chụp ảnh qua kớnh hiển vi huỳnh quang với độ phúng đại 400 lần. Đỏnh giỏ cỏc tổn thương và so sỏnh bằng phương phỏp mụ tả giải phẫu bệnh trờn mẫu tiờu bản và trờn ảnh chụp được từ
Cỏc xột nghiệm mụ bệnh học được làm tại Bộ mụn Giải phẫu bệnh - Trường Đại học Y Hà Nội với sự giỳp đỡ của PGS.TS.Trần Văn Hợp.
Nghiờn cứu về độc tớnh cấp và bỏn trường diễn của thuốc được túm tắt qua mụ hỡnh sau:
Sơ đồ 2.2: Mụ hỡnh nghiờn cứu tớnh an toàn của nấm Hồng chi.
2.3.3. Đỏnh giỏ tỏc dụng của nấm Hồng chi trờn chuột cống trắng gõy tăng cholesterol mỏu thực nghiệm: tăng cholesterol mỏu thực nghiệm:
Tiến hành tại Bộ mụn Dược lớ - Trường Đại học Y Hà Nội, năm 2007. * Gõy tăng cholesterol mỏu thực nghiệm theo phương phỏp của David. K và cộng sự [70]. Cho chuột uống cholesterol hoà tan trong dầu lạc với liều
Nghiờn cứu tớnh an toàn của nấm Hồng chi Đà Lạt Nghiờn cứu độc tớnh bỏn cấp trờn thỏ Nghiờn cứu độc tớnh cấp (LD50) Lụ 2: Uống NHC2g/kg/24h NHC10g/kg/24Lụ 3: Uống h Lụ 1: Uống NaCl 0,9%
Chỉ tiờu theo dừi:
- TLCT - HC,BC,TC,Hb, hematocrit. - ALT, AST - Ure, creatinin. - Mụ bệnh học của gan, lỏch, thận
0,5g/kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày vào buổi sỏng, trong suốt 6 tuần liền (42 ngày) để gõy tăng cholesterol mỏu.
Chuột cống trắng được chia thành 5 lụ, mỗi lụ 9 con.
- Lụ 1 (lụ chứng) (n=9): Chuột uống dầu lạc khụng cú cholesterol 0,5ml/100g thõn trọng, sau 2 giờ uống dầu lạc khụng cú cholesterol cho chuột uống nước lọc 0,5 ml/100g liờn tục trong 6 tuần.
- Lụ 2 (gõy tăng lipid mỏu, khụng trị) (n=9): Chuột uống cholesterol 10% liều 0,5g/kg/24giờ pha trong dầu lạc (0,5ml/100g), sau 2 giờ cho uống nước lọc 0,5 ml/100g liờn tục trong 6 tuần.
- Lụ 3: (gõy tăng lipid mỏu, trị bằng Cholestyramin liều 1,6g/kg/24giờ) (n=9): Chuột uống hỗn dịch cholesterol 10%, sau 2 giờ uống cholesterol cho chuột uống Cholestyramin (thuộc nhúm thuốc ức chế hấp thu và tăng thải trừ
lipid) 32% pha trong dầu lạc với cựng thể tớch như lụ 2 liờn tục trong 6 tuần. - Lụ 4: (gõy tăng lipid mỏu, trị bằng NHC liều 4g/kg/24giờ) (n=9): Chuột uống cholesterol 10% pha trong dầu lạc 0,5 ml/100g, sau 2 giờ cho chuột uống cao lỏng HC với cựng thể tớch như lụ 2 liờn tục trong 6 tuần.
- Lụ 5: (gõy tăng lipid mỏu, trị bằng NHC liều 12g/kg/24giờ) (n=9): Chuột uống hỗn dịch cholesterol 10% pha trong dầu lạc 0,5ml/100g, sau 2 giờ
cho chuột uống cao lỏng NHC với cựng thể tớch như lụ 2 liờn tục trong 6 tuần. Sau 6 tuần tiến hành lấy mỏu định lượng cholesterol toàn phần (CT), triglycerid (TG), HDL-C, LDL-C.
Sơ đồ 2.3: Đỏnh giỏ tỏc dụng của nấm Hồng chi trờn mụ hỡnh gõy tăng cholesterol mỏu chuột cống trắng.
2.3.4. Nghiờn cứu lõm sàng:
Tiến hành tại Bệnh viện YHCT Phạm Ngọc Thạch - Lõm Đồng, Bệnh viện Đa khoa YHCT - Hà Nội theo phương phỏp thử nghiệm lõm sàng mở cú so sỏnh trước và sau điều trị. Trước khi điều trị và sau điều trị 40 ngày chỳng tụi tiến hành hỏi bệnh và thăm khỏm toàn diện cho bệnh nhõn và làm cỏc xột nghiệm cận lõm sàng.
2.3.4.1. Cỏc trang bị mỏy, hoỏ chất nghiờn cứu:
a) Cỏc xột nghiệm cận lõm sàng trờn sỳc vật: kớt định lượng cỏc enzym và chất chuyển húa trong mỏu; ALT, AST, bilirubin toàn phần, albumin, cholesterol