2.4.1. Nội dung 1. Tình hình nhiễm ký sinh đƣờng máu qua phƣơng pháp nhuộm
Giemsa
Phƣơng pháp chọn lấy mẫu: Lấy đại diện tại 7 quận huyện có chăn ni bị sữa. Số mẫu ƣớc lƣợng đƣợc lấy để khảo sát đƣợc tính tốn dựa trên phần mềm Open Epi với các tham số:
- Tổng đàn bò sữa tại 7 quận huyện là 100.507 con;
- Tỷ lệ nhiễm dự kiến là 10,29% (dựa vào kết quả báo cáo của chƣơng trình cơng tác thú y phục vụ phát triển bò sữa, kiểm soát dịch bệnh của Chi cục Thú y thành phố Hồ Chí Minh: Năm 2011 là 11,48%; năm 2012 là 11,39%; năm 2013 là 9,97%; năm 2014 là 8,33%).
Kết quả tính tốn và phân bố mẫu khảo sát trình bày ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Phân bố mẫu khảo sát
Quận huyện Tổng đàn Số hộ Số lƣợng mẫu Số hộ lấy thực tế Tính tốn Thực tế Bình Chánh 2.056 151 18 45 6 Bình Tân 362 24 3 20 3 Củ Chi 68.122 7.189 596 582 66 Hóc Mơn 23.659 2.011 207 553 53 Quận 12 5.711 458 50 73 11 Quận 9 264 19 2 17 2 Thủ Đức 333 27 3 19 2 Tổng cộng 100.507 9.879 879 1.309 143
Danh sách hộ lấy mẫu xét nghiệm đƣợc chọn ngẫu nhiên từ danh sách hộ chăn nuôi của địa phƣơng bằng phần mềm excel và số lƣợng mẫu lấy tại hộ căn cứ theo tổng đàn bò cái thực tế tại hộ.
Thông tin khảo sát đƣợc thực hiện qua điều tra thăm hỏi dựa vào phiếu điều tra tại các hộ chăn nuôi (phụ lục 1).
Phƣơng pháp lấy máu và bảo quản
- Máu bò đƣợc lấy ở tĩnh mạch đuôi hoặc ở tai bằng ống tiêm vô trùng với số lƣợng 2-5 ml. Sau đó phết kính trên phiến kính, lƣợng máu cịn lại cho vào ống nghiệm vơ trùng có chứa 100µl chất kháng đông EDTA 1% (1 mg/mL), lắc nhẹ đều, sau đó cho vào thùng bảo quản mẫu đem về phịng thí nghiệm để lƣu giữ và dùng cho phản ứng PCR. Nếu chƣa xét nghiệm, mẫu sẽ đƣợc bảo quản ở nhiệt độ từ 2 - 8oC, trƣờng hợp mẫu dƣơng tính bảo quản ở -20oC.
Chỉ tiêu theo dõi
- Xác định giống ký sinh đƣờng máu ở bị.
- Xác định tình hình nhiễm Anaplasma và Babesia theo khu vực, tuổi bị, nhóm máu lai, quy mô chăn nuôi.
2.4.2. Nội dung 2. Định danh lồi dựa vào đặc điểm hình thái và kỹ thuật PCR
Tiêu bản máu nhuộm đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi, chọn 10 mẫu máu có vật thể hình quả lê trong hồng cầu (nghi ngờ Babesia) thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt để định danh loài.
Riêng những mẫu nhiễm Anaplasma chỉ quan sát bằng mắt thƣờng dƣới kính
hiển vi và định danh qua hình thái ký sinh trong hồng cầu, khơng thực hiện PCR.
Quy trình thực hiện PCR
Bƣớc 1: Ly trích DNA mẫu máu
Sử dụng theo quy trình của Dneasy Blood & Tissue kit cung cấp bởi công ty QIAGEN.
Trình tự cặp mồi đƣợc sử dụng theo nghiên cứu của Guido (2002), có điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm hiện tại.
Tên cặp mồi Ký hiệu gen (Theo Genbank) Trình tự Kích thƣớc sản phẩm khuyếch đại Babesia bigemina GAU5 (F) GAU6 (R) U06105 5'- TGGCGGCGTTTATTAGTTCG-3' 5'- CCACGCTTGAAGCACAGGA-3' 1.124 bp Babesia bovis GAU9 (F) GAU10 (R) X59604 5'- CTGTCGTACCGTTGGTTGAC-3' 5'- CGCACGGACGGAGACCGA-3' 541
Ghi chú: F: mồi xuôi; R: mồi ngược
Bƣớc 2: Thực hiện phản ứng PCR
Phản ứng PCR sử dụng GoTaq Colorless Master Mix với thành phần và chu trình nhiệt đƣợc trình bày ở Bảng 2.2 và Bảng 2.3.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng Bƣớc Nhiệt độ (o C) Thời gian Chu kì Tiền biến tính 95 2 phút 1 Biến tính 95 30 giây 30 Bắt cặp 52oC đối với B. bigemina hay
55oC đối với B. bovis
30 giây
Kéo dài 72 1 phút
Kết thúc kéo dài 72 5 phút 1
Bƣớc 3: Điện di và đọc kết quả:
Sau khi kết thúc phản ứng PCR, tiến hành điện di sản phẩm PCR trong gel agarose 1%, với thời gian 30 phút, điện thế 100 Volt.
DNA của mẫu máu bị khơng nhiễm ký sinh (đã kiểm tra qua xác định hình thái) đƣợc sử dụng làm đối chứng âm cho phản ứng PCR.
2.4.3. Nội dung 3. Khảo sát một số chỉ tiêu sinh lý máu trên bị bình thƣờng và bị
nhiễm ký sinh máu
Kiểm tra chỉ tiêu sinh lý 111 mẫu máu bằng máy huyết học tự động (trong đó có 71 mẫu máu của bò sữa nhiễm ký sinh máu và 40 mẫu máu của bị sữa khơng nhiễm).
Chỉ tiêu theo dõi:
- Số lƣợng hồng cầu (106 /mm3), - Hàm lƣợng haemoglobine (g%), - Số lƣợng bạch cầu (103 /mm3). Thành phần Thể tích (µl)
Gotaq Colorless Master Mix 12,5
Forward Primer (20 µM) 1,25
Reverse Primer (20 µM) 1,25
DNA template 2
Nƣớc cất khử ion 8
Phƣơng pháp kiểm tra chỉ tiêu sinh lý máu
- Máu kháng đông đƣợc bảo quản ở 2 - 8oC và đƣợc xử lý không quá 4 giờ sau khi lấy mẫu;
- Lấy 0,5 - 1ml máu kháng đông cho vào máy huyết học tự động (HUMACOUNT- 30Ts).
- Chờ sau 2,5 phút, máy sẽ tự động in ra kết quả của số lƣợng hồng cầu, hàm lƣợng haemoglobine, số lƣợng bạch cầu.
2.4.4. Nội dung 4. Đánh giá hiệu quả của thuốc điều trị Anaplasma và Babesia
Chỉ tiêu theo dõi
Bò đƣợc lấy máu lại để xét nghiệm bằng phƣơng pháp phết kính nhuộm Giemsa sau khi dùng thuốc trị đƣợc 7, 14 và 21 ngày. Đánh giá hiệu quả của thuốc điều trị dựa vào sự hiện diện của ký sinh trong mẫu máu.
Bố trí thí nghiệm điều trị
Quan sát các mẫu máu nhuộm Giemsa dƣới kính hiển vi. Tổng số 47 bò nhiễm
Anaplasma đƣợc sử dụng oxytetracycline với liều 10 mg/kg thể trọng, tiêm bắp 5 ngày liên tục; 24 bò nhiễm Babesia đƣợc điều trị bằng diminazene liều 3,5 mg/kg thể trọng, tiêm bắp 1 liều duy nhất và theo dõi kết quả.
2.5. Cơng thức tính và xử lý số liệu
Tỷ lệ nhiễm (%) =Số mẫu dƣơng tính
Số mẫu xét nghiệm x 100
Hiệu quả điều trị (%) = Số con khỏi bệnh
Số con đƣợc điều trị x 100
Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel và phần mềm Mintab 16, dùng trắc nghiệm Chi bình phƣơng và trắc nghiệm Fisher để so sánh các giá trị trung bình.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tình hình nhiễm ký sinh đƣờng máu qua phƣơng pháp nhuộm Giemsa 3.1.1. Các giống ký sinh đƣờng máu ở bò 3.1.1. Các giống ký sinh đƣờng máu ở bò
Tiến hành đánh giá tiêu bản máu nhuộm Giemsa từ 1.309 bò sữa trong khu vực thành phố Hồ Chi Minh. Kết quả trình bày ở Bảng 3.1, Hình 3.1 và 3.2.
Bảng 3.1. Các giống ký sinh đƣờng máu ở bò (n = 1.309)
Khu vực Quận, huyện Giống ký sinh
Anaplasma spp. Babesia spp. Quy hoạch Bình Chánh + - Củ Chi + + Hóc Mơn + + Quận 12 + + Tổng 4/4 3/4
Ngoài quy hoạch
Bình Tân + +
Quận 9 + -
Thủ Đức - -
Tổng 2/3 1/3
Tổng cộng 6/7 4/7
Dựa vào đặc điểm hình thái đã xác định 2 giống ký sinh là Anaplasma và Babesia. Anaplasma có dạng hình cầu, bắt màu tím đậm, kích thƣớc nhỏ hơn 1 µm,
thƣờng ký sinh rìa hồng cầu hoặc giữa hồng cầu (Hình 3.1). Babesia có dạng hình quả lê, hình trịn, kích thƣớc lớn hơn Anaplasma (Hình 3.2), khoảng 2 - 3 µm, thƣờng tập trung gần rìa hồng cầu. Kết quả nghiên cứu của chúng tơi khơng tìm thấy Theileria và Trypanosoma trong các mẫu máu này.
Hình 3.1. Tiêu bản máu bị nhiễm Anaplasma spp trên bò sữa
(độ phóng đại 1.000 lần)
Hình 3.2. Tiêu bản máu bị nhiễm Babesia spp trên bị sữa
(độ phóng đại 3.000 lần)
Trong 7 quận huyện khảo sát chỉ riêng quận Thủ Đức không phát hiện ký sinh đƣờng máu trên bò. Còn lại 2 địa điểm (Bình Chánh và Quận 9) phát hiện
Anaplasma và 4 địa điểm (Bình Tân, Củ Chi, Hóc Mơn và Quận 12) nhiễm cả
Tần suất xuất hiện Anaplasma tại khu vực quy hoạch là 100% (4/4 quận
huyện); tại khu vực ngoài quy hoạch là 66,67% (2/3 quận huyện). Tƣơng tự, tần suất xuất hiện Babesia tại khu vực quy hoạch là 75% (3/4 quận huyện), tại khu vực ngoài quy hoạch là 33,33% (1/3 quận huyện).
Tổng hợp các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy Trypanosoma thƣờng xuất hiện
nhiều ở miền Bắc và miền Trung hơn là miền Nam Việt Nam. Đào Trọng Đạt và Phạm Sỹ Lăng (1993) đã phát hiện trâu bò nhiễm Trypanosoma evansi ở khu vực 16 tỉnh phía Bắc. Tƣơng tự, Lƣơng Tố Thu (1995) và Vƣơng Xuân Thạch (2000) đã công bố đàn trâu tại một số tỉnh miền núi phía Bắc có tỷ lệ nhiễm T. evansi khá cao. Ở miền Trung, bò đƣợc phát hiện nhiễm T. evansi ở vài nơi nhƣ: huyện M’Drac - Đắc Lắc (Phạm Chiên và cs, 1999), huyện Ninh Hòa còn phát hiện cả Theileria
(Tào Anh Tuấn, 2004). Ở miền Nam, Hồ Thị Thuận và cs (2000) phát hiện
Trypanosoma và Theileria trên đàn bò sữa tại khu vực thành phố Hồ Chí Minh
nhƣng tỉ lệ nhiễm khá thấp (0,15% và 4,60%). Nhƣ vậy, kết quả nghiên cứu này khác với một số nghiên cứu trƣớc đây.
Tuy nhiên, một số kết quả khảo sát gần đây đã khơng tìm thấy Trypanosoma
và Theileria trên đàn bị ở các tỉnh phía Nam giống nhƣ kết quả của chúng tôi.
Nguyễn Hữu Hƣng và cs (2014) khảo sát đàn bò ở An Giang, Nguyễn Thanh Tùng (2006) khảo sát đàn bò sữa ở thành phố Hồ Chí Minh, Lê Hữu Khƣơng (2005) khảo sát đàn bò sữa và bò thịt ở huyện Củ Chi, quận 12 thành phố Hồ Chí Minh chỉ phát hiện bị nhiễm Anaplasma và Babesia, khơng có trƣờng hợp nào nhiễm Theleileria
và Trypanosoma.
3.1.2. Tỷ lệ nhiễm chung ký sinh đƣờng máu trên bò sữa
Với 1.309 mẫu máu bò sữa đã đƣợc xét nghiệm bằng phƣơng pháp nhuộm Giemsa để tìm mầm bệnh ký sinh đƣờng máu. Mẫu thu thập từ 7 quận huyện đƣợc chia thành 2 khu vực. Khu quy hoạch ni bị sữa gồm 4 quận huyện, khu ngoài quy hoạch gồm 3 quận huyện. Kết quả trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm chung theo quận huyện Khu vực Quận, Khu vực Quận, huyện Số bò khảo sát (con) Số bò nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Quy hoạch Bình Chánh 45 2 4,44 Củ Chi 582 50 8,59 Hóc Mơn 553 41 7,41 Quận 12 73 2 2,74 Tổng 1.253 95 7,58
Ngồi quy hoạch
Bình Tân 20 4 20,00
Quận 9 17 2 11,76
Thủ Đức 19 0 0,00
Tổng 56 6 10,71
Tổng cộng 1.309 101 7,72
Kết quả cho thấy có 101 bò bị nhiễm, chiếm tỷ lệ 7,72%. Tỷ lệ nhiễm ký sinh đƣờng máu trong nghiên cứu này thấp hơn so với một số nghiên cứu trƣớc đây tại Việt Nam. Ở miền Bắc, Phùng Quang Trƣờng (2008) khảo sát đàn bị sữa ni tại Ba Vì - Hà Tây phát hiện tỷ lệ nhiễm ký sinh đƣờng máu ở đàn bò Jersey là 29,7%; đàn HF là 28,6% và bò lai HF là 53,1%. Ở miền Trung, Phạm Chiên và cs (1999) cho biết 27,59% bò ở huyện M’Drac - Đắc Lắc nhiễm ký sinh đƣờng máu. Ở miền Nam, Nguyễn Hữu Hƣng và cs (2014) phát hiện 18,28% mẫu máu bị tại huyện Tri Tơn và Tịnh Biên tỉnh An Giang nhiễm ký sinh đƣờng máu trong tổng số 640 mẫu máu khảo sát. Tại thành phố Hồ Chí Minh, theo Nguyễn Thanh Tùng (2006) đàn bị sữa có tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng đƣờng máu là 16,98% nhƣng theo Lê Hữu Khƣơng (2005) thì đàn bị sữa ở huyện Củ Chi có tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng đƣờng máu cao hơn (38%) và Hồ Thị Thuận (2000) cũng cho rằng 24,27% bò ở đây nhiễm ký sinh đƣờng máu.
Tỷ lệ phát hiện bệnh ký sinh đƣờng máu ở bò tại khu vực quy hoạch là 7,58% thấp hơn so với khu vực ngoài quy hoạch (10,71%). Kết quả của chúng tôi cho thấy xu hƣớng nhiễm ký sinh đƣờng máu theo khu vực ngƣợc lại với kết quả của Nguyễn
Thanh Tùng (2006). Tác giả cho biết tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng đƣờng máu tại các quận huyện Bình Chánh, Củ Chi, Hóc Mơn và Quận 12 (17,45%) cao hơn so với 03 quận huyện Bình Tân, Thủ Đức và Quận 9 (12,67%). Kết quả này trái ngƣợc với hiện nay. Điều này có thể do trong vịng 10 năm qua (2006 - 2015), thơng qua chƣơng trình lấy mẫu giám sát định kỳ và hỗ trợ điều trị ký sinh đƣờng máu cho các hộ chăn ni bị sữa của Chi cục thú y thành phố Hồ Chí Minh đã phát huy hiệu quả.
3.1.3. Tình hình nhiễm Anaplasma và Babesia
Để hiểu rõ hơn tình hình nhiễm của từng loại ký sinh, chúng tơi tiến hành phân tích tình hình nhiễm ký sinh theo địa điểm và khu vực. Kết quả trình bày ở Bảng 3.3a và 3.3b.
Bảng 3.3a. Tỷ lệ nhiễm Anaplasma và Babesia theo địa bàn quận huyện
Quận/huyện Số bò khảo sát (con)
Anaplasma Babesia Số nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Số nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Bình Chánh 45 2 4,44ab 0 0,00 Củ Chi 582 37 6,36 ab 13 2,23 Hóc Mơn 553 32 5,79 ab 9 1,63 Quận 12 73 1 1,37 a 1 1,37 Bình Tân 20 3 15,00 b 1 5,00 Quận 9 17 2 11,76 ab 0 0,00 Thủ Đức 19 0 0,00 0 0,00 Tổng 1.309 77 5,88 24 1,83
Bảng 3.3b. Tỷ lệ nhiễm Anaplasma và Babesia theo khu vực
Khu vực Số bò khảo sát (con)
Anaplasma Babesia Số nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Số nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Quy hoạch 1.253 72 5,75 23 1,84
Không quy hoạch 56 5 8,93 1 1,79
Tổng cộng 1.309 77 5,88 24 1,83
Trong số 1.309 bị khảo sát có 77 bị nhiễm Anaplasma chiếm tỷ lệ 5,88% và 24 bò nhiễm Babesia chiếm tỷ lệ 1,83%. Trong q trình khảo sát khơng phát hiện trƣờng hợp nào nhiễm ghép chung giữa Anaplasma và Babesia.
Kết quả khảo sát trong nghiên cứu này cho thấy tỷ lệ nhiễm Anaplasma
(5,88%) của đàn bị sữa ở Thành phố Hồ Chí Minh đã giảm nhiều so với những năm trƣớc đây. Năm 2000, Hồ Thị Thuận và cs điều tra cho thấy tỷ lệ nhiễm đối với
Anaplasma là 11,02%. Năm 2005, Lê Hữu Khƣơng ghi nhận tỷ lệ nhiễm là 33%.
Năm 2006, khảo sát của Nguyễn Thanh Tùng là 16,28%. Kết quả của các tác giả này cho thấy tỷ lệ nhiễm Anaplasma ở bò khá cao so với kết quả trong nghiên cứu này.
Xét về khu vực, tỷ lệ nhiễm Anaplasma trong khu vực quy hoạch chăn ni bị sữa (5,75%) có xu hƣớng thấp hơn so với khu vực không quy hoạch (8,93%). Tuy nhiên, trƣớc đây theo khảo sát của Nguyễn Thanh Tùng (2006) thì tỷ lệ nhiễm
Anaplasma trên đàn bò sữa ở 4 quận huyện thuộc khu vực quy hoạch hiện nay
(16,67%) cao hơn so với khu vực không quy hoạch (12,67%). Điều này cho thấy lợi ích của chính sách hỗ trợ ngƣời dân trong khu quy hoạch phát triển chăn ni bị sữa đã góp phần làm giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh ký sinh đƣờng máu.
Xét về địa điểm, đã có 6 trong 7 quận huyện phát hiện bị nhiễm Anaplasma.
Trong đó, Quận Bình Tân có bị nhiễm cao nhất (15%) và Quận 12 thấp nhất (1,37%). Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,05). Ở Quận Thủ Đức không phát hiện bò nhiễm Anaplasma. Trƣớc đây, Nguyễn Thanh Tùng (2006) cũng cho biết bò ở Thủ Đức nhiễm Anaplasma rất thấp (5,00%).
Qua khảo sát, tỷ lệ nhiễm Babesia trên đàn bò khá thấp (1,83%). Kết quả này thấp hơn rất nhiều so với kết quả nghiên cứu của Lê Hữu Khƣơng (2005) và Hồ Thị Thuận (2000) (5% và 8,45%) nhƣng cao hơn của Nguyễn Thanh Tùng (2006) (0,7%). Xét về khu vực, kết quả khảo sát cho thấy khơng có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm Babesia trên đàn bò sữa giữa khu vực quy hoạch (1,84%) với khu vực không quy hoạch (1,79%). Về địa điểm, 4 trong 7 quận huyện đã phát hiện bị nhiễm
Babesia. Trong đó, Quận Bình Tân cũng có tỷ lệ nhiễm cao nhất (5%) và Quận 12 có
tỷ lệ nhiễm thấp nhất (1,37%).
Tỷ lệ nhiễm Anaplasma và Babesia theo tuổi
Bên cạnh phân tích theo khu vực và địa điểm, chúng tơi tiến hành đánh giá tỷ lệ nhiễm Anaplasma và Babesia theo tuổi bị. Kết quả trình bày ở Bảng 3.4 và Hình 3.3.
Bảng 3.4. Tỷ lệ nhiễm Anaplasma và Babesia theo tuổi Nhóm tuổi Nhóm tuổi (năm) Số bị khảo sát (con) Anaplasma Babesia Số nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Số nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) < 01 36 1 2,78 2 5,56 01 - <02 120 7 5,83 4 3,33 02 – <03 265 16 6,04 6 2,26 03 – <04 430 27 6,28 4 0,93 04 – <05 309 21 6,80 6 1,94 ≥ 05 149 5 3,36 2 1,34 Tổng cộng 1.309 77 5,88 24 1,83
Hình 3.3. Tỷ lệ nhiễm Anaplasma và Babesia theo nhóm tuổi
Kết quả phân tích cho thấy tỷ lệ nhiễm Anaplasma có khuynh hƣớng tăng dần