3.2. Kết quả định danh loài ký sinh
3.2.2. Định danh Babesia bằng phƣơng pháp PCR
Với 10 mẫu máu nhiễm Babesia đƣợc chọn (trong đó có 02 mẫu nghi ngờ
dƣơng tính do có xuất hiện vật lạ) để kiểm tra bằng kỹ thuật PCR. Kết quả trình bày ở Bảng 3.9, Hình 3.7a và 3.7b.
Hình 3.7a. Kết quả mẫu dƣơng tính với B. bigemina
Chú thích: Cột 1: Thang chuẩn, cột 2: Đối chứng âm; cột 3: THUAN3702, cột 4: THUAN17457, cột 5: UT14, cột 6: ÚT9; cột 7: DUNG23470, cột 8: THUY7, cột 9: THU512, cột 10: KIEN489, cột 11: KIEN094, cột 12: KIET772.
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi GAU 5 và GAU 6. Kết quả đã có 4 mẫu (Cột 9, 10, 11 và 12) cho băng điện di rõ và có kích thƣớc sản phẩm khoảng 1.124 bp ứng với Babesia bigemina. Nhƣ vậy, những mẫu máu có mã số THU512, KIEN489, KIEN094 và KIET772 nhiễm loài B. bigemina.
Tƣơng tự, phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi GAU 9 và GAU 10. Kết quả đã có mẫu máu có mã số THUAN17457 (Cột 4) cho băng điện di rõ và có kích thƣớc sản phẩm khoảng 541 bp ứng với Babesia bovis.
Hình 3.7b. Kết quả mẫu dƣơng tính với B. bovis
Chú thích: Cột 1: Thang chuẩn, cột 2: Đối chứng âm; cột 3: THUAN3702, cột 4: THUAN17457, cột 5: UT14, cột 6: UT9; cột 7: DUNG23470, cột 8: THUY7, cột 9: THU512, cột 10: KIEN489, cột 11: KIEN094, cột 12: KIET772.
Một số tác giả thực hiện PCR với các cặp mồi GAU5/GAU6 và GAU9/GAU10 cũng có kết quả tƣơng tự. Guido (2002) cho biết cặp mồi GAU5/GAU6 đƣợc chọn từ gen SS rRNA của B.bigemina và cặp mồi GAU9/GAU10 đƣợc chọn từ gen SS rRNA của B. bovis. Quá trình khuếch đại PCR của các đoạn gen đặc hiệu SS rRNA ở B. bigemina đã đạt kết quả tốt bằng đoạn mồi GAU5/GAU6 (kích thƣớc sản phẩm khoảng
1.124 bp). Tƣơng tự, Gen SS rRNA của B. bovis cũng đƣợc khuyếch đại chuyên biệt
bằng đoạn mồi GAU9/GAU10 (kích thƣớc sản phẩm 541). Chaudhry và cs (2010) phân tích gen SS rRNA dựa vào PCR phát hiện Babesia một cách hiệu quả, kết quả điện di thể hiện đặc hiệu của sản phẩm PCR cho kết quả mẫu dƣơng tính đối với B. bovis ở
băng điện di là 541bp và mẫu dƣơng tính với B. bigemina ở băng điện di 1.124bp. Kết quả trên cho thấy đàn bị sữa ở thành phố Hồ Chí Minh hiện đang nhiễm loài Babesia bigemina và Babesia bovis. Nguyễn Văn Hậu và cs. (1999) đã sử dụng kỹ thuật PCR để kiểm tra mẫu máu bò tại khu vực Ba Vì (Hà Nội) và Trại Tân Thắng (TP. Hồ Chí Minh) cũng chỉ phát hiện 2 loài là Babesia bigemina và Babesia bovis. Đây là 2 loài gây bệnh phổ biến ở bò của Việt Nam.
Bảng 3.8. Kết quả nhiễm Babesia qua phƣơng pháp PCR
Số lƣợng mẫu Phƣơng pháp kiểm tra
Nhuộm Giemsa PCR
8 8 mẫu nhiễm Babesia 04 mẫu nhiễm Babesia
bigemina; 04 mẫu âm tính.
02 02 mẫu nghi ngờ nhiễm
Babesia (do có vật lạ)
01 mẫu nhiễm Babesia bovis; 01 mẫu âm tính
Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm Babesia bigemina cao hơn gấp 4 lần so với Babesia bovis. Tỷ lệ nhiễm này khác so với một số kết quả nghiên cứu trƣớc đây tại
miền Nam. Nguyễn Văn Hậu (1999) kiểm tra phân tích 120 mẫu bị bằng phƣơng pháp PCR có kết quả dƣơng tính đối với Babesia bigemina là 23,33%; với Babesia
bovis là 21,67%.
Trong 10 mẫu nhiễm đã kiểm tra hình thái bằng phƣơng pháp nhuộm Giemsa chỉ có 5 mẫu dƣơng tính qua kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR. Nhƣ vậy, phƣơng pháp kiểm tra hình thái qua kính hiển vi để xác định ký sinh trùng đƣờng máu đã có những trƣờng hợp dƣơng tính giả. Phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng phụ thuộc nhiều vào các yếu tố nhƣ thiết bị, cách phết máu, cách thức nhuộm, cƣờng độ nhiễm... Ngƣợc lại, kỹ thuật PCR rất hiệu quả, có độ chuyên biệt và chính xác cao nhƣng địi hỏi trang bị máy và thiết bị khá tốn kém về mặt kinh tế.
Nguyễn Văn Hậu và cs (1999) cho rằng việc chẩn đoán theo phƣơng pháp làm tiêu bản kiểm tra qua kính hiển vi rất khó xác định lồi nhiễm và đạt hiệu quả thấp. Kỹ thuật PCR là kỹ thuật có hiệu quả, có độ chính xác cao, chẩn đốn đƣợc sớm và có thể chẩn đốn cùng một lúc nhiều mẫu. Tuy nhiên, El-Ashker (2015) cũng khuyến cáo rằng việc kiểm tra lâm sàng kết hợp với soi kính hiển vi vẫn là hữu hiệu trong chẩn đốn các trƣờng hợp cấp tính của bệnh Babesia và Anaplasma; bên cạnh đó, việc kết hợp với xét nghiệm chẩn đoán sinh học phân tử sẽ phát hiện đƣợc cả bị mang trùng khơng triệu chứng.