Quận huyện Tổng đàn Số hộ Số lƣợng mẫu Số hộ lấy thực tế Tính tốn Thực tế Bình Chánh 2.056 151 18 45 6 Bình Tân 362 24 3 20 3 Củ Chi 68.122 7.189 596 582 66 Hóc Mơn 23.659 2.011 207 553 53 Quận 12 5.711 458 50 73 11 Quận 9 264 19 2 17 2 Thủ Đức 333 27 3 19 2 Tổng cộng 100.507 9.879 879 1.309 143
Danh sách hộ lấy mẫu xét nghiệm đƣợc chọn ngẫu nhiên từ danh sách hộ chăn nuôi của địa phƣơng bằng phần mềm excel và số lƣợng mẫu lấy tại hộ căn cứ theo tổng đàn bò cái thực tế tại hộ.
Thông tin khảo sát đƣợc thực hiện qua điều tra thăm hỏi dựa vào phiếu điều tra tại các hộ chăn nuôi (phụ lục 1).
Phƣơng pháp lấy máu và bảo quản
- Máu bò đƣợc lấy ở tĩnh mạch đuôi hoặc ở tai bằng ống tiêm vô trùng với số lƣợng 2-5 ml. Sau đó phết kính trên phiến kính, lƣợng máu cịn lại cho vào ống nghiệm vô trùng có chứa 100µl chất kháng đông EDTA 1% (1 mg/mL), lắc nhẹ đều, sau đó cho vào thùng bảo quản mẫu đem về phịng thí nghiệm để lƣu giữ và dùng cho phản ứng PCR. Nếu chƣa xét nghiệm, mẫu sẽ đƣợc bảo quản ở nhiệt độ từ 2 - 8oC, trƣờng hợp mẫu dƣơng tính bảo quản ở -20oC.
Chỉ tiêu theo dõi
- Xác định giống ký sinh đƣờng máu ở bò.
- Xác định tình hình nhiễm Anaplasma và Babesia theo khu vực, tuổi bị, nhóm máu lai, quy mơ chăn nuôi.
2.4.2. Nội dung 2. Định danh lồi dựa vào đặc điểm hình thái và kỹ thuật PCR
Tiêu bản máu nhuộm đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi, chọn 10 mẫu máu có vật thể hình quả lê trong hồng cầu (nghi ngờ Babesia) thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt để định danh loài.
Riêng những mẫu nhiễm Anaplasma chỉ quan sát bằng mắt thƣờng dƣới kính
hiển vi và định danh qua hình thái ký sinh trong hồng cầu, không thực hiện PCR.
Quy trình thực hiện PCR
Bƣớc 1: Ly trích DNA mẫu máu
Sử dụng theo quy trình của Dneasy Blood & Tissue kit cung cấp bởi cơng ty QIAGEN.
Trình tự cặp mồi đƣợc sử dụng theo nghiên cứu của Guido (2002), có điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm hiện tại.
Tên cặp mồi Ký hiệu gen (Theo Genbank) Trình tự Kích thƣớc sản phẩm khuyếch đại Babesia bigemina GAU5 (F) GAU6 (R) U06105 5'- TGGCGGCGTTTATTAGTTCG-3' 5'- CCACGCTTGAAGCACAGGA-3' 1.124 bp Babesia bovis GAU9 (F) GAU10 (R) X59604 5'- CTGTCGTACCGTTGGTTGAC-3' 5'- CGCACGGACGGAGACCGA-3' 541
Ghi chú: F: mồi xuôi; R: mồi ngược
Bƣớc 2: Thực hiện phản ứng PCR
Phản ứng PCR sử dụng GoTaq Colorless Master Mix với thành phần và chu trình nhiệt đƣợc trình bày ở Bảng 2.2 và Bảng 2.3.