Ở nƣớc ta, do điều kiện trang thiết bị chƣa cao nên các phòng chẩn đoán ở trung ƣơng và địa phƣơng hiện chỉ sử dụng các kỹ thuật đơn giản để chẩn đoán ký sinh, chƣa có điều kiện áp dụng các phƣơng pháp miễn dịch để chẩn đoán bệnh (Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân, 2000).
Ngày nay, những phƣơng pháp nghiên cứu hiện đại đã giúp cho việc chẩn đoán các bệnh ký sinh đƣờng máu đạt đƣợc độ chính xác cao có thể trên 95% nhƣ phƣơng pháp polymerase chain reaction (PCR), latex, phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFAT). Trong đó phƣơng pháp PCR là một trong những phƣơng pháp mới và có hiệu quả cao trong cơng tác chẩn đốn nhƣng nó địi hỏi phải có trang bị và phƣơng tiện đắt tiền, kỹ thuật phải chính xác (Phạm Sỹ Lăng, 2002).
1.3.1. Phƣơng pháp xem tƣơi
Theo Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân (2000), sử dụng một phiến kính sạch khơ, nhỏ lên đó một vài giọt dung dịch chống đơng máu (natri citrat). Dùng kéo cắt lông sát trùng tĩnh mạch tai. Lấy một giọt máu cho lên lame, phủ lamel lên và quan sát với độ phóng đại 10 x 40. Trypanosoma sẽ di chuyển giữa các hồng cầu nếu có. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có độ chính xác chỉ đạt khoảng 70%.
1.3.2. Phƣơng pháp phết kính nhuộm Giemsa
Lấy máu tĩnh mạch cổ hoặc tĩnh mạch tai, phết tiêu bản dàn mỏng. Cố định bằng cồn methanol, nhuộm giem sa và kiểm tra dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 1.000 lần để tìm ký sinh trùng đƣờng máu.
Lấy dịch trong hạch lâm ba nhuộm Romanopsky để phát hiện Theileria spp., độ
chính xác trong chẩn đoán đạt 80%. Phƣơng pháp này có thể phát hiện bào tử của
Theileria spp. trong bạch cầu của bị. Độ chính xác trong phát hiện bệnh do Anaplasma
Các mẫu lấy từ bò sống, bao gồm các mẫu máu phết mỏng trên kính và máu thu thập đƣợc trong chất kháng đơng. Các mẫu máu phết kính để khơ trong khơng khí sẽ giữ đƣợc hồn hảo ở nhiệt độ phịng ít nhất 1 tuần. Mẫu máu trong chất kháng đông nên đƣợc bảo quản và vận chuyển ở 4o
C, nếu không phải đƣợc đƣa đến phịng thí nghiệm trong vịng vài giờ. Mẫu này có thể dùng cho việc phết kính, nếu các mẫu loại khác gởi đến là khơng hồn hảo. Ngƣợc lại với Babesia bovis, Anaplasma khơng tích tụ trong các mao mạch, do vậy máu lấy từ tĩnh mạch cảnh hay mạch máu lớn khác là thích hợp.
Các mẫu máu đƣợc nhuộm với màu Giemsa 10%, trong khoảng 30 phút, sau khi cố định trong methanol nguyên chất trong khoảng 1 phút. Sau khi nhuộm màu, các mẫu đƣợc rửa xả ba hay bốn lần với nƣớc sạch để loại bỏ màu cịn dƣ, và sau đó để khơ trong khơng khí. Các điều kiện cho nhuộm màu Giemsa khác nhau giữa các phịng thí nghiệm. Các màu nhuộm thƣơng mại tiện cho nhuộm màu Anaplasma
nhanh chóng hiện có sẵn trong một số quốc gia (Màu nhuộm thƣơng mại, bao gồm Camco-Quik and Diff-Quik, Baxter Scientific Products, McGaw Park, Illinois, USA, và Hema 3 and Hema-Quik, Curtin-Matheson, Houston, Texas, USA). Các mẫu đƣợc kiểm tra dƣới lớp dầu ở độ phóng đại x 700 - 1.000 (Gualito, 2015)
Anaplasma marginale thể hiện là các thể đặc, tròn và đậm màu trong hồng cầu,
có đƣờng kính khoảng 0,3 - 1,0 µm. Hầu hết các thể này nằm trong hay gần với viền của hồng cầu. Đặc tính này giúp phân biệt giữa A. marginale với A. centrale, do hầu hết các A. centrale thƣờng nằm trong hồng cầu ở gần trung tâm hơn. Tuy nhiên, đặc biệt là khi nhiễm rickettsia máu thấp, việc phân biệt hai loài này trong các mẫu có thể khó khăn (Kreier và Ristic, 1963; Stich và cs, 2004).
Phƣơng pháp truyền thống để nhận diện tác nhân gây bệnh ở thú bị nhiễm
Babesia là kiểm tra bằng kính hiển vi các mẫu máu phết kính dày và mỏng, đƣợc
nhuộm màu, nhƣ màu Giemsa (Thuốc nhuộm Romanowsky - Giemsa 10% trong môi trƣờng PBS (phosphate buffered saline). Độ nhạy của kỹ thuật này có thể phát hiện tình trạng nhiễm ký sinh trùng máu đến mức thấp là 1 ký sinh trùng trong 106 hồng cầu.
Các mẫu máu phết kính dày đƣợc chuẩn bị bằng đặt một giọt máu nhỏ (khoảng 50 µl) lên một phiến kính sạch. Giọt máu này sau đó đƣợc làm khơ trong khơng khí, đƣợc cố định bằng nhiệt ở 80oC trong 5 phút, và đƣợc nhuộm với Giemsa 10% trong 15 - 20 phút. Các mẫu máu không nhuộm màu sẽ không đƣợc bảo quản với các dung dịch formalin vì có thể ảnh hƣởng đến chất lƣợng nhuộm màu.
Việc phân biệt loài thực hiện tốt trong các mẫu phết kính mỏng, nhƣng kém trong các mẫu phết kính dày. Kỹ thuật này thƣờng đủ để phát hiện bệnh nhiễm cấp tính, nhƣng khơng phát hiện đƣợc thú mang trùng khi tình trạng ký sinh trùng trong máu thƣờng rất thấp. Việc nhận diện và phân biệt ký sinh trùng có thể đƣợc cải thiện bằng sử dụng màu huỳnh quang, nhƣ màu cam acridine thay cho Giemsa.
1.3.3. Phƣơng pháp tiêm truyền chuột bạch
Lấy máu ở tĩnh mạch tai của trâu bị nghi bệnh cho vào ống nghiệm có chứa citrat natri 3,8%, sau đó tiêm máu vừa thu đƣợc vào phúc mạc chuột thí nghiệm và theo dõi từ 15 – 30 ngày. Kiểm tra máu chuột thí nghiệm, nếu trong máu chuột có hiện diện mầm bệnh chứng tỏ trâu bò đã bị nhiễm bệnh.
Phƣơng pháp tiêm truyền động vật có thể cho độ chính xác cao (100%) đối với bệnh do Trypanosoma evansi. Tuy nhiên, tốn công sức cho việc chăm sóc thú thí
nghiệm và theo dõi trong thời gian dài (Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân, 2000).
1.3.4. Phƣơng pháp tập trung
Dựa vào nguyên lý Babesia thƣờng ký sinh trong hồng cầu non, khi ly tâm
hồng cầu non tập trung ở đáy. Lấy máu cho vào ống hematocrit, sau khi ly tâm phần đáy là hồng cầu non. Tìm Babesia ở phần tập trung hồng cầu non.
1.3.5. Phƣơng pháp ngƣng kết (card agglutination test - CAT)
Dùng kháng nguyên sống trong máu động vật cảm nhiễm (bê, thỏ). Sau đó nhỏ một giọt huyết thanh của động vật nghi bệnh và trộn với giọt máu có kháng nguyên sống của động vật cảm nhiễm. Nếu huyết thanh có kháng thể tƣơng ứng sẽ có ngƣng kết xảy ra.
Bản chất của phƣơng pháp là ngƣng kết trực tiếp trên phiến polyethylen. Phƣơng pháp này có độ chính xác trong phát hiện Trypanosoma là 70 - 80%; Babesia,
Anaplasma và Theileria đạt 90 - 95% (Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân, 2000).
1.3.6. Phƣơng pháp huỳnh quang gián tiếp (indirect immunofluorescen test – IFA) IFA)
Dùng chất phát quang để phát hiện phản ứng kháng nguyên và kháng thể. Kháng nguyên đã biết đƣợc ni cấy từ động vật thí nghiệm. Kháng thể có trong huyết thanh gia súc nghi bệnh. Kiểm tra trên kính hiển vi huỳnh quang. Phản ứng dƣơng tính khi có phát màu huỳnh quang của ký sinh trùng.
Phƣơng pháp này có ƣu điểm là phát hiện chính xác trâu bị bệnh ký sinh trùng đƣờng máu, đạt 90 - 96% và phát hiện sớm đƣợc bệnh từ 5 - 6 ngày trong thời gian ủ bệnh (Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân, 2000).
1.3.7. Phản ứng ELISA (enzyme - linked immuno sorbent assay)
Dùng kháng nguyên đã gắn enzyme, nhỏ lên vỉ 96 lỗ, sau đó cho huyết thanh gia súc nghi ngờ vào. Sau một thời gian phản ứng, cho conjugate và subtrate vào, tiếp tục cho chất dừng phản ứng (thƣờng là H2SO4). Đọc kết quả thông qua máy đọc ELISA.
Phƣơng pháp này có ƣu điểm là phát hiện trâu bò bệnh ký sinh trùng đƣờng máu đạt độ chính xác cao 90 - 98%. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cần phải có kháng thể hoặc kháng nguyên chuẩn (Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân, 2000).
1.3.8. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)
Với độ nhạy cao, kỹ thuật PCR đƣợc coi là phƣơng pháp hiện đại nhất hiện nay để chẩn đoán bệnh. Trong phản ứng này dùng phản ứng PCR đa mồi để chẩn đoán cả 02 loại Babesia bigemina, B. bovis hoặc cả 3 loại Babesia bigemina, B. bovis, Anaplasma marginale. Độ nhạy của kỹ thuật này có thể phát hiện tình trạng
nhiễm ký sinh trùng máu đến mức thấp là 1 ký sinh trùng trong 107 hồng cầu. Các xét nghiệm dựa vào acid nucleic để phát hiện bệnh nhiễm A. marginale
trên bò đã đƣợc phát triển mặc dù chƣa đầy đủ. Độ nhạy phân tích của các phƣơng pháp dựa vào phản ứng chuỗi phân tử (PCR) đã đƣợc ƣớc tính có thể phát hiện tình trạng nhiễm ký sinh trùng máu mức thấp là 1 ký sinh trùng trong 106 hồng cầu, nhƣng ở mức độ này, chỉ một phần bò mang trùng đƣợc phát hiện. Một xét nghiệm
nested PCR có độ nhạy và có khả năng nhận diện, đã đƣợc áp dụng để nhận diện bò mang trùng A. marginale. Kỹ thuật này có khả năng nhận diện đến ít hơn 30 hồng
cầu bị nhiễm trong 1 ml máu, tƣơng đƣơng có thể phát hiện tình trạng nhiễm ký sinh trùng máu đến mức thấp là 1 ký sinh trùng trong 108 hồng cầu, thấp hơn mức độ mang trùng thấp nhất của bò. Phƣơng pháp Real-time PCR cũng đã đƣợc chỉ định để định danh A. marginale (Carelli và cs, 2007; Decaro và cs, 2008; Reinbold và cs, 2010) và đƣợc xem xét để thay thế Nested PCR. Thiết bị cần thiết cho Real- time PCR thì mắc tiền, địi hỏi phải bảo dƣỡng. Xét nghiệm Real-time PCR nhắm mục tiêu gen 16S rRNA (Reinbold và cs, 2010) và đƣợc báo cáo đạt đƣợc một mức độ phân tích độ nhạy tƣơng đƣơng Nested PCR (Carelli và cs, 2007; Decaro và cs, 2008; Reinbold và cs, 2010).
Xét nghiệm phản ứng PCR đã đƣợc chứng minh là rất nhạy, đặc biệt trong phát hiện B. bovis và B. bigemina trong bò mang trùng (Buling và cs, 2007; Costa- Junior và cs, 2006; Criado-Fornelio, 2007). Một số kỹ thuật PCR đã đƣợc mơ tả mà có thể phát hiện và phân biệt các loài của Babesia trong thú mang trùng (Buling và cs, 2007; Criado-Fornelio, 2007). Các xét nghiệm PCR thƣờng có ích cho xác nhận các xét nghiệm và trong một số trƣờng hợp, dùng làm xét nghiệm kế tiếp các phƣơng pháp khác.