CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỦY SẢN
1.3.2 Phương pháp hóa học và hóa sinh
Các phương pháp hóa học và hóa sinh dùng để đánh giá chất lượng thủy sản có độ lặp lại cao và chính xác. Nhóm phương pháp này khơng mang yếu tố chủ quan của con người trong việc đánh giá chất lượng sản phẩm. Ngồi ra, nhóm các phương pháp này cũng liên quan đến chất lượng cảm quan và các hợp chất hóa học sinh ra từ quá trình ươn hỏng do vi sinh vật, quá trình phân hủy do hóa học gây ra [105]. Hiện nay để đánh gíá độ tươi thủy sản, hầu hết sử dụng phương pháp đánh giá cảm quan kết hợp với vài phương pháp đo khác nhau [180]. Dưới đây là một số thành phần hóa học hình thành từ q trình tự phân và phân hủy do vi sinh vật, enzyme và hóa học. Chúng được xác định để từ đó có thể ước tính chất lượng của thủy sản.
1.3.2.1 Tổng base dễ bay hơi
Trong thủy sản, tổng hàm lượng base dễ bay hơi có chứa nitơ (TVB-N) bao gồm trimethylamine (TMA hình thành từ sự hư hỏng do vi sinh vật), ammonia (hình thành từ sự khử amine của amino acid và chuyển hóa các nucleotide) và dimethylamine (DMA hình thành từ enzyme tự phân trong suốt quá trình bảo quản lạnh). Chỉ số TVB-N được cho là liên quan nhiều tới giai đoạn sau của quá trình ươn hỏng [208]. Mức TVB-N liên quan tới chất lượng thủy sản, có thể nhìn thấy qua các nghiên cứu trên cá thu [199], cá tuyết Atlantic [29], cá mồi [9], [126] và lươn [193]. Như vậy, TVB-N là một chỉ số chất lượng phù hợp để đánh giá chất lượng thủy sản trong quá trình bảo quản. Hàm lượng TVB-N được xác định chủ yếu bằng hai phương pháp. Phương pháp thứ nhất theo tiêu chuẩn EC, protein được loại bỏ bằng acid perchloric, sau đó TVB-N được xác định qua quá trình chưng cất mẫu trong môi trường kiềm tạo bởi magie oxide MgO. Phương pháp thứ hai sử dụng acid trichloroacetic trích ly, sau đó chưng cất trong mơi trường kiềm tạo bởi NaOH [261]. Ở Việt Nam, hàm lượng TVB-N được xác định theo TCVN 9215-2012 [7], dựa trên tiêu chuẩn đánh giá của EC.
1.3.2.2 Trimethylamine
Một loại ươn hỏng do vi sinh vật gây ra, được xác định là do sự phân hủy trimethylamine oxide (TMAO) thông qua hoạt động của enzyme TMAOase có cơng thức phân tử (CH3)3NO. Thủy sản sau khi chết, vi khuẩn hoạt động chuyển hóa
TMAO thành TMA, chất này được cho là nguyên nhân chủ yếu tạo mùi ươn đặc trưng [179-180]. Ở các lồi thủy sản, TMAO có vài trị duy trì điều hịa áp suất thẩm thấu trong cơ thể sinh vật. Hàm lượng TMAO trong thủy sản khác nhau ở các lồi, độ tuổi, kích cỡ, thời gian trong năm và các yếu tố môi trường [94]. Cá biển có từ 1–100 mg TMAO trong 100 gam cơ thịt, trong khi đó cá nước ngọt chỉ có khoảng 5–20 mg/100 gam cơ thịt [145]. TMA có thể được dùng như một chỉ số đánh giá ươn hỏng và không phù hợp để đo độ tươi. Cá tươi có hàm lượng TMA nhỏ hơn 1,5mg TMA/100gam và giá trị này tăng suốt trong quá trình ươn hỏng. Cá được xem không đạt chất lượng khi hàm lượng TMA cao hơn 30 mg/100g (cá tuyết) [28]. Nhiều phương pháp đã đu7ọc xây dựng để xác định TMA, DMA, TVB-N, bao gồm phương pháp chưng cất [150], khuếch tán và chuẩn độ Conway [52], phương pháp quang phổ [103], phương pháp sắc ký khí (GC) [260], phương pháp điện di mao quản [250], phương pháp phân tán dòng [60].
1.3.2.3 Dimethylamine
Như đã đề cập trên, TMAO trong thủy sản được chuyển hóa thành TMA bởi vi khuẩn. Trong suốt thời gian bảo quản lạnh hay lạnh đông, điều kiện phát triển của vi khuẩn bị ức chế, hoạt động này được thay thế bởi chuyển hóa chậm do enzyme và hình thành dimethylamine (DMA) và formaldehyde [105], [230]. Những hợp chất này hình thành có thể là ngun nhân gây ra một vài biến đổi chất lượng trong thời gian bảo quản. Lượng DMA hình thành phụ thuộc vào lồi (trừ loài cá thu và một số lồi khác khơng tìm thấy DMA) và thời gian bảo quản [171]. DMA có thể được sử dụng như một chỉ số đo độ ươn trong quá trình bảo quản lạnh đơng của một vài lồi cá như cá thu đông lạnh [59]. DMA được xác định bằng phương pháp HPLC với kỹ thuật sắc ký pha đảo [247]. Trong đó, DMA được tạo dẫn xuất tiền cột với fluorenylmethylchloroformate tạo ra sản phẩm huỳnh quang. Sản phẩm huỳnh quang của DMA được tách khỏi hỗn hợp dẫn xuất của các amine và acid amine qua cột C18 với chế độ rửa giải gradient bao gồm dung dịch A (đệm phosphate 6,5: acetonitrile = 50:50) và dung dịch B (đệm phosphate pH = 6,5: acetonitrile = 25: 75) thời gian lưu là 15 phút.
1.3.2.4 Amine sinh học
Các amine sinh học là các hợp chất hữu cơ có tính base và khối lượng phân tử thấp hình thành từ phản ứng decarboxyl hóa các acid amine; phản ứng amine hóa và deamine hóa aldehyde và ketone. Chúng cũng hình thành từ q trình chuyển hóa ở thực vật, động vật và vi sinh vật [26], [213], [222], [249]. Các amine sinh học thường hiện diện ở nồng độ thấp trong thực phẩm, chúng hình thành từ sự chuyển hóa các acid amine tự do trong thủy sản, dưới tác động của vi khuẩn và enzyme gây hư hỏng [39], [228]. Lượng và loại amine sinh học phụ thuộc vào thành phần thực phẩm và loại vi khuẩn hiện diện trong thực phẩm [249]. Các vi khuẩn thường hiện diện trong thực phẩm như Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Klebsiella, Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Photobacterium, Lactobacillus, Pediococcus và Streptococcus có khả năng decarboxyl hóa các acid amine. Những vi sinh vật này có
thể hiện diện sẵn trong thực phẩm hay lây nhiễm do kỹ thuật đánh bắt không hợp lý, do kỹ thuật chế biến. Các chủng Klebsiella pneumonia của loài Morganella morganii và một vài chủng Hafnia alvei dễ tạo ra histamine [62], [142], [222], [249]. Hàm
lượng các amine sinh học hình thành trong cá rất cao, đặc biệt là histamine, putrescine, cadaverine và tyramine [100], [258].
Nhìn chung, hàm lượng các acid amine sinh học tồn tại ở nồng độ cao trong thủy sản là do nguyên nhân kỹ thuật bảo quản không hợp lý, dẫn tới vi sinh vật thực hiện tiến trình decarboxyl hóa các acid amine [100]. Thêm vào đó, một vài lồi, đặc biệt các loài thuộc họ Scombridae như cá ngừ và họ Clupeidae như cá mồi, có sự hiện diện của histamine với nồng độ cao trong cơ thịt [122-123], [142-143], [182]. Vì vậy, các amine sinh học có thể được sử dụng như các chỉ số chất lượng, do chúng liên quan tới quá trình ươn hỏng làm biến đổi chất lượng [197], [258].
Trong các amine sinh học, histamine là mối nguy và là nguyên nhân dẫn tới ngộ độc [163]. Các thành phần khác như putrescine và cadaverine làm tăng khả năng gây độc của histamine [246]. Nồng độ cho phép tương ứng của histamine là 5 mg/100 g và 20 mg/100 g trong cá, theo quy định của Cục quản lý thực phẩm, dược phẩm Hòa Kỳ (US/FDA) [75] và EU [61].
1.3.2.5 Chỉ số amine sinh học
Ở cá tươi amine sinh học có nồng độ thấp nhưng hiện diện cao hơn khi có sự tham gia của vi khuẩn trong quá trình phân hủy [229]. Đánh giá hàm lượng amine sinh học không chỉ liên quan đến độc tố, mà cịn có thể sử dụng như một chỉ số để đo chất lượng thực phẩm [13], [197], [219], [228]. Chỉ số chất lượng (QI) và chỉ số amine sinh học (BAI) được Mietz và Veciana-Nogués cùng cộng sự [159], [259] đưa ra để đánh giá chất lượng cá với công thức như sau:
𝑄𝐼 = (ℎ𝑖𝑠𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑒 + 𝑝𝑢𝑡𝑟𝑒𝑠𝑐𝑖𝑛𝑒 + 𝑐𝑎𝑑𝑎𝑣𝑒𝑟𝑖𝑛𝑒)
1 + 𝑠𝑝𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑒 + 𝑠𝑝𝑒𝑟𝑚𝑖𝑑𝑖𝑛𝑒
𝐵𝐴𝐼 = (ℎ𝑖𝑠𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑒 + 𝑝𝑢𝑡𝑟𝑒𝑠𝑐𝑖𝑛𝑒 + 𝑐𝑎𝑑𝑎𝑣𝑒𝑟𝑖𝑛𝑒 + 𝑡𝑦𝑟𝑎𝑚𝑖𝑛𝑒) Trong đó các đại lượng amine sinh học được thính theo đơn vị mol/lít. Các tác giả quan sát thấy rằng chỉ số chất lượng tăng khi điểm cảm quan của cá ngừ đóng hộp giảm. Vì vậy, họ đồng ý sản phẩm có QI dưới 1 là có chất lượng tốt nhất. Ngược lại, sản phẩm với QI lớn hơn 10 sẽ có chất lượng kém và bị nhiễm vi sinh vật ươn hỏng. Từ đây có rất nhiều nhóm nghiên cứu đã sử dụng hai công thức trên để đánh giá chất lượng trên nhiều loài khác nhau [25], [159], [258]. Fathi cùng cộng sự [68] đã sử dụng histamine để khảo sát biến đổi chất lượng ở mẫu cá shanak yellow fish (Acanthopagrus latus). Kết quả cho thấy hàm lượng histamine đạt cao nhất 3,4mg/100g ở mẫu cá bảo quản 18 ngày. Histamine cũng được chọn là chỉ số đánh giá biến đổi chất lượng trên cá tuyết, cá trích và scomber (một chi của cá thu đại dương) [77].
Có nhiều kỹ thuật khác nhau cho việc xác định hàm lượng các amine sinh học, bao gồm sắc ký bản mỏng [224], [236], HPLC [106], [160], [265] và sử dụng cảm biến sinh học [175]. Trong các kỹ thuật này, HPLC là phù hợp nhất do độ nhạy, độ tin cậy và độ lặp lại của phương pháp cao.
1.3.2.6 Sự tự phân ATP và các sản phẩm của quá trình tự phân ATP
Adenosine triphosphate là một nucleoside triphosphate, đóng vai trị quan trọng trong việc cung cấp năng lượng cho tế bào hoạt động. Ở các sinh vật sống, ATP được tái tổng hợp từ adenosine diphosphate (ADP) thơng qua q trình cộng hợp với nhóm phosphat (PO43-). Sau khi động vật chết, các tiến trình sinh lý vẫn tiếp tục thêm một
khoảng thời gian nữa cho đến khi nồng độ oxy giảm và creatinine phosphate dự trữ cho tiến trình tái tạo ATP cạn kiệt. Lúc này, ATP nhanh chóng bị phân hủy bởi một loạt quá trình dephosphoryl và deamine tạo ra những hợp chất khác nhau (Hình 1.1).
Nhìn chung, sự phân hủy đều xảy ra tương tự nhau ở các loài thủy sản. Tuy nhiên, tỷ lệ và mơ hình phân hủy là khác nhau tùy thuộc các loài, loại cơ thịt, điều kiện sinh học (giới tính, điều kiện sinh lý), mùa trong năm, nhiệt độ nước, phương pháp đánh bắt và điều kiện căng thẳng (stress) khi đánh bắt, phương pháp xử lý và bảo quản [93], [162].
Saito cùng cộng sự [220] là những người đầu tiên đề xuất đưa chỉ số K để đánh giá chất lượng thủy sản. Giá trị K được tính dựa trên nồng độ của ATP và các dẫn xuất. Giá trị K được tính theo cơng thức sau:
Dựa trên giá trị K Saito cùng cộng sự [220], đã phân loại vài loài cá trên thị trường như sau:
K < 20%: cá rất tươi, phù hợp làm nguyên liệu.
20% < K < 40%: Cá được xem là tươi cho quá trình chế biến.
K > 40%: Cá không phù hợp cho tiêu thụ
Cho đến nay, nhiều nhóm nghiên cứu vẫn dùng chỉ số K để khảo sát, đánh giá chất lượng của nhiều loài thủy sản khác nhau. Kết quả của các nghiên cứu này cho thấy có sự khác nhau về khoảng giá trị K giữa các lồi, khơng giống như kết luận của Saito cùng cộng sự [138], [256], [285]
Indole là một trong những chỉ số chất lượng được đề nghị ở cá [63], lồi thủy sản có vỏ và các sinh vật biển khác như cua. Indole được chấp nhận là chỉ số đánh giá chất lượng trong nghiên cứu của Quaranta cùng cộng sự [204, 205]. Ở cá và loài thủy sản có vỏ, indole hình thành từ q trình chuyển hóa tryptophan do vi khuẩn gây ra. Chuyển hóa này xảy ra ngay ở nhiệt độ bảo quản lạnh [240]. Ở thực phẩm lạnh đơng, indole hình thành ngay thời điểm ban đầu bảo quản đến khi rã đơng. Nó có thể được xác định bằng các phương pháp quang phổ, HPLC [241] hay bằng phổ huỳnh
quang [203]. Hàm lượng indole cho phép là từ 3 đến 6 pg/l00 g cá [263]. Cá có thể được xem là không chấp nhận khi hàm lượng indole đạt 6,50 pg/100g. Tuy nhiên, khơng thể dùng nó để xác định mức độ phân hủy như trường hợp ammoniac vì dễ mất đi trong quá trình bảo quản.
1.3.2.7 pH
Giá trị pH cũng là một thông số quan trọng liên quan đến chất lượng thủy sản [105]. Giá trị pH sau khi chết từ 5,5 đến 7,1 phụ thuộc theo mùa, loài và các yếu tố khác [87], [231]. Động vật sau khi chết thường trải qua giai đoạn co cứng và ở giai đoạn này pH có giá trị thấp. Giá trị pH thấp được cho là liên quan đến trạng thái trước khi chết [21], [164]. Đây là nguyên nhân do suy giảm năng lượng dự trữ, chủ yếu là glycogen bị phân giải hình thành acid lactic làm pH giảm. Ở trạng thái pH thấp, các hoạt động của enzyme và vi khuẩn tăng mạnh dẫn đến những phản ứng phân hủy xảy ra. Ngoài ra, pH thấp sẽ dẫn đến liên kết giữa các phân tử nước với mô cơ giảm. Điều này liên quan tới các thuộc tính cảm quan như độ bóng và trạng thái bề mặt.
1.3.2.8 Các chỉ số đo sự oxy hóa lipid
Trong suốt q trình chế biến và bảo quản, sự oxy hóa do enzyme và phi enzyme cùng xảy ra. Có sự tương quan chặt chẽ giữa tiến trình oxy hóa lipid và sự suy giảm chất lượng của thủy sản [99]. Ở loài cá béo, lipid bị oxy hóa mạnh dẫn đến sự ơi hóa và có thể cảm nhận qua mùi vị ơi đặc trưng. Riêng đối với loại cá gầy đông lạnh sự phân hủy protein làm cho cấu trúc của cá bị khơ và cứng [149].
Thủy sản có hàm lượng lipid không no cao trong điều kiện bảo quản lạnh hay lạnh đông, các hợp chất sinh ra từ q trình oxy hóa lipid có thể tương tác với protein. Sự tương tác này làm phân hủy protein, thành phần dinh dưỡng giảm [41], [218], [227]. Có nhiều yếu tố tác động lên sự ơi hóa, các yếu tố này liên quan đến mật độ liên kết đôi, loại thủy sản, chất làm thúc đẩy hay ức chế q trình oxy hóa, độ ẩm, điều kiện về oxy, nhiệt độ và ánh sáng [45], [46]. Như đã đề cập trên, các hợp chất hydroperoxide (ROOH) sinh ra từ q trình ơi hóa lipid. Các hydroperoxide khơng bền dễ bị phân hủy hình thành các aldehyde, cetone và alcohol gọi là những sản phẩm thứ cấp. Các chất này là những chất dễ bay hơi và là nguyên nhân tạo ra mùi ôi đặc
trưng. Hàm lượng peroxide ở thủy sản có thể sử dụng để đo mức độ oxy hóa trong những thời điểm đầu. Giá trị peroxide thường được biểu thị qua chỉ số PV. Các chỉ số chủ yếu biểu thị cho mức độ ơi hóa là chỉ số acid (AV), chỉ số peroxide (PV) và acid thiobarbituric (TBA). Hai chỉ số AV và TBA đặc trưng cho các sản phẩm thứ cấp của tiến trình oxy hóa lipid. Trong thời gian bảo quản thủy sản kéo dài các chỉ số PV, AV và TBA đạt cực đại, sau đó giảm [19], [158].