CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6 PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.6.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát các chỉsố chất lượng hóa học biến đổi trong quá trình
trình bảo quản
2.6.3.1 Chuẩn bị mẫu cho các quá trình khảo sát
Mẫu tơm dùng cho các quá trình khảo sát biến đổi chỉ số chất lượng hóa học được chuẩn bị theo mục 2.3.1.
2.6.3.2 Bố trí các thí nghiệm khảo sát sự biến đổi các chỉ số chất lượng
Thí nghiệm 6: Chọn lựa phương pháp xác định hypoxanthine trên mẫu tôm sú
Mục tiêu: Tìm điều kiện tối ưu cho phương pháp xác định hypoxanthine trong tôm sú bằng phương pháp HPLC.
Bố trí: Phương pháp định lượng hypoxanthine trên thiết bị HPLC được xây dựng dựa trên các nghiên cứu trước [127] và phương pháp của Công ty Nacalai đưa ra để xác định các thành phần ATP, ADP, AMP, IMP và hypoxanthine (chỉ số K) trong đánh giá độ tươi của thủy sản [267]. Hypoxanthine ở tơm sú được trích ly theo nghiên cứu Ryder [217]. Tơm sau khi lột vỏ, bỏ đầu được xay nhuyễn. Tiếp theo, cân 3 gam mẫu cho vào ống nghiệm có nắp (ống ly tâm) và cho 10 mL acid perchloric 0,6M. Tiến hành trích ly 10 phút trên máy SCILOGEX-MX-E với tốc độ lắc 3000 vòng/phút, rồi ly tâm bằng thiết bị Hettich-EBA 20S với chế độ 3000 vòng/phút, trong 10 phút. Thu lấy phần chất lỏng. Lập lại tiến trình trên 3 lần. Tồn bộ dịch trích sau ly tâm được cho vào bình định mức 50 mL và định mức bằng acid perchloric 0,6 M. Dịch sau khi rửa giải được phân tích trên thiết bị HPLC theo hai điều kiện chạy sắc ký sau:
Phương pháp 1: dựa trên các nghiên cứu [127] với chế độ phân tích: pha động là dung dịch K2HPO4 0,5 M có pH 4,6; tốc độ dịng 1ml/phút, nhiệt độ cột 30 oC, detector DAD đặt ở λ = 248 nm, cột tách 5C18 PAQ (250 x 4 mm x 5 µm) Cosmosil, thể tích tiêm 20 µl.
Phương pháp 2: dựa trên nghiên cứu ứng dụng của nhà sản xuất Nacalai [267] công bố (24/11/2015), với điều kiện chạy như sau: Cột 5C18-PAQ, kích cỡ ID 4,6 mm- 250 mm, pha động phosphate 0,02 M, pH 7, tốc độ dòng 1ml/phút, nhiệt độ cột 30 oC, detector DAD đặt ở λ = 260 nm. Từ kết quả khảo sát, lựa chọn phương pháp thích hợp nhất cho q trình nghiên cứu.
Thí nghiệm 7: Xây dựng đường chuẩn, hiệu suất thu hồi, giá trị LOD, LOQ và
RSD.
Mục tiêu: Xác định phương trình đường chuẩn, hiệu suất thu hồi %H, giới hạn LOD, LOQ và hệ số RSD của phương pháp xác định hypoxanthine trên nền mẫu tôm sú bằng HPLC.
Bố trí: Các bước tiến hành trình tự như sau.
Xác định phương trình đường chuẩn: tiến hành điều kiện chạy sắc ký theo phương pháp chọn lựa ở thí nghiệm 6 với các chuẩn hypoxanthine 0,01; 0,05; 0,1;
0,5; 1; 3; 5ppm. Kết quả của các lần chạy được xem xét để đưa ra phương trình hồi quy tuyến tính.
Xác định hiệu suất thu hồi H: Trên cùng một mẫu tôm được bảo quản ở điều kiện 0 oC tiến hành trên hai mẫu song song:
Mẫu đối chứng: Xác định hàm lượng hypoxanthine trong mẫu 1 ghi nhận kết quả
Mẫu khảo sát: Thêm chính xác một lượng hypoxanthine vào mẫu 2 rồi để yên khoảng thời gian. Tiến hành xác định hàm lượng hypoxanthine trên mẫu 2.
Làm 3 lần, lấy kết quả trung bình, hiệu suất thu hồi H được tính như sau: 𝐻 = 𝑦 − 𝑥
𝑚 100%
Với: Giá trị x là lượng hypoxanthine tìm thấy ở mẫu đối chứng. Giá trị y là lượng hypoxanthine tìm thấy ở mẫu khảo sát. Giá trị m là lượng hypoxanthine tiêm vào ở mẫu khảo sát.
Xác định LOD và LOQ: Mẫu tôm ngày thứ nhất được chọn cho q trình thí nghiệm. Tiến hành trích ly 3 gam thịt tơm (như thí nghiệm 6) bằng acid perchloric 0,6 M. Tiến hành trích ly ba lần, mỗi lần với10ml acid perchloric 0,6 M. Thu bã tôm cịn lại, tiếp tục trích bằng 20 mL acid perchloric 0,6M. Dịch thu được dùng làm mẫu trắng để khảo sát. Trên nền mẫu trắng tiến hành tạo các dung dịch có nồng độ 0,05; 0,04; 0,03; 0,02; 0,01 ppm v.v…lần lượt chạy sắc ký theo điều kiện từ kết quả thí nghiệm 5. Trên phần mềm điều khiển (Agilent chemstation) xác định giá trị S/N (signal to noise) của từng dung dịch cho đến khi S/N ≥ 6. Xác định nồng độ thỏa mãn T = S/N ≥ 6 giả sử là Cm. Sử dụng dung dịch có nồng độ này thực hiện thí nghiệm xác định LOD và LOQ. Giá trị LOD = 3×Cm / T và LOQ = 3× LOD [3].
Xác định RSD: Giá trị RSD được xác định dựa trên bố trí 10 thí nghiệm khác nhau trên cùng một chuẩn hypoxanthine 1 ppm. Nồng độ được xác định lại dựa trên phương trình đường chuẩn xây dựng cùng thời điểm. Giá trị RSD tính theo [6] như sau:
𝑆𝐷 = √∑(𝑋𝑖 − 𝑋𝑡𝑏)
2 𝑛 − 1
𝑅𝑆𝐷 = 𝑆𝐷
𝑋𝑡𝑏100%
Thí nghiệm 8: Khảo sát hàm lượng TVB-N trong các mẫu tôm sú theo ngày bảo
quản.
Mục tiêu: Xác định lượng TVB-N trong các mẫu tôm sú theo ngày bảo quản. Tìm mối tương quan giữa TVB-N và các chỉ số chất lượng hóa học khác.
Bố trí: Áp dụng quy trình phân tích TVB-N theo tiêu chuẩn TCVN 9215- 2012 [7], khảo sát hàm lượng TVB-N trên các mẫu tôm bảo quản theo ngày ở 0 oC. Các thí nghiệm được tiến hành 3 lần trên một mẫu.
Thí nghiệm 9: Khảo sát hàm lượng TMA-N trong các mẫu tôm sú theo ngày bảo quản.
Mục tiêu: Xác định lượng TMA-N trong các mẫu tôm sú theo ngày bảo quản.
Bố trí: Các mẫu tơm sú được bảo quản ở 0 oC dùng cho thí nghiệm. Phương pháp định lượng áp dụng quy trình phân tích TMA-N theo tiêu chuẩn AOAC 971.14 [103], khảo sát hàm lượng TMA-N trên các mẫu tôm lưu trữ theo ngày ở 0 oC. Các thí nghiệm được tiến hành 3 lần trên một mẫu.
Thí nghiệm 10: Khảo sát hàm lượng histamine trong các mẫu tôm sú theo ngày
bảo quản.
Mục tiêu: Xác định hàm lượng histamine trong các mẫu tôm sú theo ngày bảo quản.
Bố trí: Tiến hành khảo sát hàm lượng histamine trong tôm ở các ngày bảo quản ở 0 oC. Histamine được xác định theo nghiên cứu Gouygou cùng cộng sự [83]. Mẫu tôm khảo sát sau khi lột vỏ được trích ly 3 lần, mỗi lần 40 mL ethanol ở 60 oC, sau đó ly tâm thu dịch, dịch trích ly được định mức 150 mL bằng ethanol. Histamine được làm sạch trên cột SPE C18, rửa giải bằng đệm borat có pH = 10. Các thí nghiệm được tiến hành 3 lần trên một mẫu.
Thí nghiệm 11: Khảo sát hàm lượng hypoxanthine trong các mẫu tôm sú theo
ngày bảo quản.
Mục tiêu: Xác định hàm lượng hypoxanthine trong các mẫu tôm sú theo ngày bảo quản.
Bố trí: Tiến hành khảo sát hàm lượng hypoxanthine trong tôm ở các ngày bảo quản ở 0 oC. Hypoxanthine được xác định dựa trên kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm 6. Thí nghiệm được tiến hành 3 lần trên một mẫu.
Thí nghiệm 12: Khảo sát giá trị pH trong các mẫu tôm sú theo ngày bảo quản.
Mục tiêu: Xác định giá trị pH trong các mẫu tơm sú theo ngày bảo quản.
Bố trí: Các mẫu tơm bảo quản ở 0 oC được chuẩn bị theo ngày bảo quản khác nhau bắt đầu từ ngày 1. Giá trị pH của các mẫu tôm sú đo theo Özogul cùng cộng sự [193] bằng thiết bị đo pH (pH-meter Orion TM Star 211). Các thí nghiệm được tiến hành 3 lần trên một mẫu.