CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TÔM SÚ
2.4.2 Phương pháp xác định tồng vi sinh vật hiếu khí
2.4.2.1 Phương pháp thực hiện
Phương pháp xác định tồng vi sinh vật hiếu khí (total viable count – TVC) được tiến hành theo Leboffe cùng cộng sự [140]. Vi sinh vật sau khi phân lập từ mẫu được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng phù hợp sau khoảng thời gian nhất định. Giá trị TVC được xác định dựa trên việc đếm số khuẩn lạc tìm thấy.
2.4.2.2 Mơi trường và hóa chất
Môi trường Plate count agar (PCA) + Casein peptone: 5,0g
+ Cao nấm men: 2,5g + Dextrose: 1,0g + Agar: 15,0g
+ Nước cất đủ 1000 mL
Cân đầy đủ các thành phần môi trường, phối trộn, điều chỉnh pH 7,0 ± 0,2. Nấu sôi nhẹ cho tan agar. Phân phối mơi trường vào bình tam giác. Hấp tiệt trùng ở 121
oC /20 phút, để ấm (45-50 oC) phân phối vào các đĩa Petri.
Nước muối sinh lý 0,9%
Nước cất vô trùng.
Ethanol 96 o
2.4.2.3 Tiến hành thí nghiệm
a. Xử lý mẫu
Chuẩn bị một số ống nghiệm chứa 9 mL nước muối hoặc nước peptone vô trùng, 2 erlen 250 mL:
Bình 1 chứa 90 mL nước muối sinh lý hoặc nước peptone 1,0 % vô trùng.
Bình 2 đã vơ trùng và khơng chứa gì cả.
Cho một ít ethanol vào cối chày sứ và đốt lên để khử trùng, để nguội.
Cân 25g mẫu (khoảng 1 con) cho vào cối chày sứ, nghiền nát mẫu hoặc đồng nhất mẫu trong túi dập mẫu với máy dập mẫu.
Dùng tồn bộ nước ở bình 1 để chuyển mẫu sang bình 2. Lắc 5 phút.
Để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng như trong trường hợp mẫu ở trạng thái lỏng.
Hình 2.2 Phương pháp pha loãng bậc 10 dung dịch huyền phù
b. Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên mơi trường thạch (ISO 4833:1991)[111]
Pha lỗng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau: 10-3, 10-4, 10-5 để cấy mẫu.
Ghi vào nắp hộp petri có mơi trường thạch các thơng tin: nồng độ pha loãng, ngày cấy.
Dùng pipet đã vô trùng lấy 1mL dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa petri (đã vô trùng).
Cho khoảng 15 mL môi trường PCA ở nhiệt độ khoảng 45 oC vào hộp petri. Xoay chậm cho hỗn hợp trộn đều. Để yên cho nguội. Lật ngược cho vào tủ ấm. Nuôi cấy ở 30 oC trong 72 giờ.
Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ. Mỗi nồng độ cấy 3 hộp petri.
Sau đó lấy ra kiểm tra kết quả.
c. Cách đếm
Lấy bút chì kẻ 2 đường vng góc ở đáy hộp petri và đánh dấu thứ tự từng vùng I, II, III, IV.
Đếm số lượng khuẩn lạc từng vùng và đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm.
Số lượng tế bào trong một gam mẫu được tính theo cơng thức sau đây: ) ... ( ) / ( 1 1vd nivdi n C ml CFU N Với:
N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu. CFU: colony form units)
C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn (có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25-250 khuẩn lạc/đĩa)
ni: Số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ i
di: hệ số pha loãng tương ứng.
v: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa
(a) (b) (c)
Hình 2.4 Các loại dụng cụ đếm khuẩn lạc
(a) Bút đếm khuẩn lạc, (b) Bàn đếm khuẩn lạc, (c) Máy đếm khuẩn lạc tự động