- Chuẩn bị mẫu đất: mẫu đất bảo quản trong túi nhựa được trộn đều lên, sau đó định lượng 100g.
- Xử lý mẫu đất: ngâm và hòa tan đất trong nước bằng cách cho mẫu đất vào một xô nhựa có dung tích 5 lít đổ thêm 500 ml nước cất vào, ngâm từ 30 – 60 phút tùy thuộc vào loại đất. Bóp vụn đất và khuấy đều để đồng nhất mẫu đất cho đất tan thành dịch huyền phù.
- Lọc thô loại bỏ cặn thô: dịch đất từ xô 1 được lọc qua rây lọc thô số 1 (kích thước lỗ 0.5 mm) sang xô 2. Cặn trên rây được rửa lại bằng nước sạch, sau đó loại bỏ cặn đất và rác bẩn còn lại trên rây.
- Gạn lọc: phần dung dịch đất có chứa tuyến trùng trong xô 2 tiếp tục được khuấy đều và gạn lọc từ xô 2 về xô 1, trong khi gạn lọc phải xoay vòng xô để cạn được giữ lại trên xô (chứ không phải đổ thẳng từ xô này qua xô khác vì như vậy sẽ nôi kéo cạn theo khi đổ) và tiếp tục lặp lại 5-7 lần, tùy loại đất mà gạn lọc cho đến khi loại bỏ hết cặn đất và cát nặng, chỉ còn lại dịch chứa tuyến trùng ở dạng huyền phù.
- Ly tâm lần 1, loại bỏ nước: chuyển dung dịch huyền phù vào 2 ống ly tâm thêm 4g bột kaolin vào mỗi ống và khuấy đều bằng đũa thủy tinh. Trước khi đặt vào các
ống ly tâm vào máy ly tâm phải được cân đều nhau (chỉnh cân để kim về tâm trước khi cân) và đặt đối xứng. Ly tâm lần 1, ở tốc độ 3000 vòng trong 5 phút. Sau khi ly tâm đổ bỏ phần dung dịch ở phía trên giữ lại cặn chứa tuyến trùng.
- Ly tâm lần 2, tách tuyến trùng ra khỏi cặn: thêm dung dịch đường saccaro có tỷ trọng 1,18 (484g đường/ 1 lít nước), khuấy đều trong thời gian tối thiểu là 30 giây. Các ống ly tâm được cân chỉnh cho bằng nhau và tiến hành ly tâm lần thứ 2 ở tốc độ 3000 vòng trong 5 phút. Kết quả ly tâm lần này, tuyến trùng sẽ tách khỏi cặn treo lơ lửng trong dung dịch. Đổ dung dịch chứa tuyến trùng này qua rây lọc tinh có kích thước lỗ 15µm, tuyến trùng sẽ được giữ trên rây.Chuyển tuyến trùng vào cốc thủy tinh bằng bình tia có chứa dung dịch formon 4 % để bảo quản.
Xử lý mẫu Ngâm mẫu (30-60 phút) Lọc qua rây lọc thô 0,5 mm
Gạn lọc (5-7 lần) Chuyển dung dịch vào ống ly tâm Thêm bột kaolin
Cân đều 2 ống ly tâm Ly tâm lần 1 Thêm dung dịch đường (1,18)
Khuyấy đều dịch đường Ly tâm lần 2 Thu tuyến trùng trên giấy lọc15µm
2.2.15 Phƣơng pháp đếm tuyến trùng [5]
Tuyến trùng được đếm bằng đĩa đếm tuyến trùng (countinh dish) và bút đếm dưới kính hiển vi soi nổi. Trong trường hợp mẫu có ít tuyến trùng có thể đổ cả tuyến trùng vào đĩa đếm. Sau khi lắc nhẹ cho dung dịch chứa tuyến trùng dàn đều, có thể đếm toàn bộ tuyến trùng theo các dãy ô cho toàn bộ đĩa hoặc có thể đếm đại diện một số ô hoặc dãy, sau đó tính trung bình một ô và nhân với tổng số ô trong đĩa. Trong trường hợp mẫu có quá nhiều tuyến trùng có thể pha loãng dung dịch tuyến trùng thành 30 ml, sau đó lấy 1 ml bằng pipepman để đếm, lặp lại 5 lần như vậy, tính trung bình số lượng tuyến trùng trên 1 ml rồi nhân với 30.
Hình 2.5 Hình ảnh đếm tuyến trùng 2.2.16 Phƣơng pháp thử độc tính [20] Chuẩn bị dịch chiết
Cân 25 gram mẫu chế phẩm NemaITB được nghiền và ngâm trong 100ml nước cất khoảng 24 giờ. Sau đó ly tâm và lọc qua giấy lọc Whatman để thu dịch lọc, dịch chiết này được xem như dịch nguyên chất (nồng độ 25%) dùng để khảo sát. Các dịch chiết này được pha loãng 5, 10, 20 và 40 lần với nước cất.
Phương pháp thử độc tính in vitro
Hút 1ml dịch huyền phù tuyến trùng chứa khoảng 20 tuyến trùng cảm nhiễm cho vào đĩa petri. Sau đó thêm vào 10ml dịch chiết cần khảo sát, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Đặt đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Theo dõi phần trăm (%) tuyến trùng chết sau 12, 24 và 48 giờ.
2.2.17 Phƣơng pháp thử nghiệm trên cây trồng
Thử nghiệm trong điều kiện nhà luới
Thí nghiệm được thực hiện tại vườn ươm viện Sinh Học Nhiệt Đới từ tháng 02 năm 2009. Tiêu giâm hom 5 tháng tuổi được đưa trở lại bầu, cứ 02 hom tiêu được đưa vào một bầu có đường kính 20x20 cm, với đất đã được xử lý nhiệt để làm sạch tuyến trùng. Bổ sung nồng độ chế phẩm cần khảo sát trước 7 ngày lây nhiễm. Tách tuyến trùng cảm nhiễm tuổi 2 từ rễ hồ tiêu thu ở Bình Dương (phương pháp lọc tĩnh, mô tả ở mục 2.2.13). Lây nhiễm tuyến trùng vào cây chủ: tạo 03 hố nhỏ xung quanh cây chủ, dùng bơm xylanh có đầu kim dài cỡ 10 cm hút lượng dung dịch chứa khoảng 800 ấu trùng cảm nhiễm tuổi 2, sau đó cho vào 03 hố đó (lưu ý vừa bơm vừa rút kim lên để cho dịch tuyến trùng được phân bố đều trong đất). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần có đối chứng và bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Theo dõi và phân tích sau 30 và 60 ngày lây nhiễm.
Thử nghiệm ở ngoài đồng ruộng
Từ những kết quả thu được trên cây hồ tiêu ở điều kiện vườn ươm. Bước đầu chúng tôi kết hợp với hộ dân trồng tiêu ở Ấp Bầu Trư, xã An Bình, Phú Giáo, Bình Dương sơ bộ đánh giá hiệu quả của chế phẩm.
Chế phẩm NemaITB dạng bột được khuyến cáo sử dụng 100g/gốc tiêu trưởng thành. Cách bón như sau: Theo độ dốc của vườn tiêu, ở phía trên độ dốc cách 30 cm tới tâm gốc tiêu tạo đường vòng tròn bán nguyệt, còn đất bằng phẳng thì tạo đường vòng tròn cách 30 – 40 cm tới tâm gốc tiêu để đảm bảo không ảnh hưởng đến bộ rễ của cây tiêu, rắc chế phẩm vào và phủ một lớp đất mỏng lên để tránh bị rửa trôi khi mưa.
Theo dõi và phân tích sau mỗi tháng. Chỉ tiêu theo dõi:
- Thành phần lý hóa của đất sau mỗi tháng bón chế phẩm
CHƢƠNG 3
3.1Kết quả phân tích lý hóa và sinh học của chế phẩm dùng trong nghiên cứu
Tiến hành khảo sát một số chỉ tiêu lý hóa và sinh học của chế phẩm theo các phương pháp đã trình bày ở mục 2.2 và thu được kết quả như sau:
Bảng 3.1 Các chỉ tiêu lý hóa và sinh học của chế phẩm NemaITB
STT Các chỉ tiêu Chế phẩm NemaITB 1 pH 7,49 2 Độ ẩm (%) 15,2 3 Chất hữu cơ 63 4 Nitơ tổng số (%) 4,4 5 Hàm lượng Protein tổng số (%) 27,3 6 Hàm lượng Cacbon tổng số (%) 36,5 7 Phốt pho dạng P2O5 (%) 1,4 8 Axít humic (%) 12,4
9 Hàm lượng mốc T. harzianum (CFU/g) 2,5.108
Nhận xét:
Số liệu ở bảng 3.1 trên cho thấy chế phẩm NemaITB có hàm lượng chất hữu cơ rất cao (63 %). Nhìn chung chế phẩm trên được xem là một trong những nguồn phân hữu cơ tốt, góp phần cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng. Ngoài ra, kết quả kiểm tra vi sinh vật hữu ích cho thấy chế phẩm NemaITB có mật độ nấm T. harzianum
tương đối cao (2,5.108 CFU/g). Điều này cho thấy chế phẩm NemaITB có nhiều thành phần dinh dưỡng tốt cho cây trồng đồng thời nấm T. harzianum sẽ giúp cải tạo đất trồng và giúp phần nào kiểm soát nấm bệnh trong đất.
3.2Định tính hoạt chất azadirachtin của sản phẩm chiết xuất từ chế phẩm NemaITB NemaITB
Chế phẩm NemaITB có thành phần chính là bột neem, đây là nguyên liệu giàu hoạt chất sinh học và được nhiều nước trên thế giới sử dụng làm thuốc bảo vệ thực vật gốc thảo mộc. Theo TS. Vũ Văn Độ (2007) dùng HPLC định lượng các hoạt chất (azadirachtin, salannin, nimbin) trong bột neem, kết quả nhận thấy hoạt chất azadirachtin chiếm chủ yếu (0,35%), còn các hoạt chất khác rất thấp (salannin 0,058% và nimbin 0,012%). Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi sử dụng phương pháp định tính azadirachtin bằng sắc ký bản mỏng nhằm mục đích kiểm tra xem chế phẩm có hoạt chất azadirachtin hay không. Tiến hành định tính trên sắc ký bản mỏng theo các bước đã mô tả ở mục 2.2.12 phương pháp nghiên cứu. kết quả ghi nhận ở hình 3.1
Hình 3.1 Sắc ký đồ dịch chiết từ chế phẩm NemaITB
Ghi chú: (1) Azadirachtin chuẩn của hãng Sigma;
(2) Chế phẩm NemaITB. Azadirachtin
So sánh vệt azadirachtin chuẩn (hình 3.1-1) trên sắc ký đồ nhận thấy chế phẩm NemaITB chứa azadirachtin (hình 3.1-2), song chúng có hàm lượng azadirachtin rất thấp (theo lý thuyết vệt màu càng rõ thì hàm lượng azadirachtin càng cao). Ngoài vệt azadirachtin ra trên hình 3.1-2 còn xuất hiện niều vệt khác. Điều này cho thấy ngoài hoạt chất chính là azadirachtin còn có nhiều chất khác, có thể là hoạt chất limonoid, triterpenoid, v.v. [11].
3.3Kết quả thử nghiệm dịch chiết của chế phẩm NemaITB ở điều kiện in vitro
Bảng 3.2 Tỉ lệ % tuyến trùng chết do tác động của chế phẩm NemaITB Nồng độ dịch chiết
của chế phẩm NemaITB (%)
% tuyến trùng chết sau
12 giờ 24 giờ 48 giờ
0 0 0 0 0,6 58 68 84 1,2 77 92 96 2,5 83 91 100 5,0 88 96 100 25,0 100 100 100
0 20 40 60 80 100 120
12 giờ 24 giờ 48 giờ
Thời gian phơi nhiễm (giờ)
% số lƣ ợn g tu yế n tr ùn g ch ết NĐ 0% NĐ 0.6% NĐ 1.2% NĐ 2.5% NĐ 5% NĐ 25%
Đồ thị 3.1 Tỉ lệ % tuyến trùng chết do tác động của chế phẩm NemaITB
Nhận xét: Bảng 3.2 cho thấy hầu hết tuyến trùng đều chết sau 12 giờ thử nghiệm ở dịch chiết nguyên chất. Và sau 24 giờ, dịch chiết với nồng độ 5 và 2,5% cũng làm chết 96% đến 91% số tuyến trùng thử nghiệm. Ở nồng độ 5 và 2,5% sau 48 giờ thí nghiệm đã làm chết hoàn toàn tuyến trùng và ở dịch chiết với nồng độ 1,25% đã làm chết 96% tuyến trùng ngay cả ở nồng độ 0,625% cũng làm chết 84% tuyến trùng sau 48 giờ.
Kết quả thu được ở trên cũng đã khẳng định chế phẩm NemaITB là loại thuốc thảo mộc dùng để kiểm soát tuyến trùng ký sinh thực vật rất hiệu quả, thân thiện với môi trường và an toàn cho người sử dụng. Điều này có thể được giải thích như sau: trong chế phẩm NemaITB có chứa bột neem đây là nguyên liệu giàu hoạt chất sinh học (azadirachtin, salannin, nimbin) và những dẫn xuất của nó thuộc các nhóm hoạt chất triterpenoid, limonoid, v.v. đã được chứng minh có độc tính mạnh với tuyến trùng ký sinh (Khan et al., 1966; Singh, R.S and Sitaramaiah, K., 1966; Adegbite A.A. và Adesiyan S.O., 2005) [13, 20, 22]. Hoạt động kiểm soát chủ yếu của bột neem là ngăn cản tuyến trùng xâm nhập, ức chế không cho tuyến trùng đẻ trứng và
phát triển [20]. Mặt khác, tác giả Singh và cộng sự (1979) cũng cho rằng việc bổ sung neem vào đất lâu ngày sẽ phóng thích một số chất độc đối với tuyến trùng, làm giảm sự chuyển hóa của dazomet, oxamyl, dichlorofenthion giúp ngăn chặn việc mất nitrogen ban đầu và ô nhiễm mạch nước ngầm [20]. Hơn nữa, nghiên cứu của Riga và Lazarrovits (2001) cũng cho biết bột neem độc với nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật nhưng không làm ảnh huởng đến những vi sinh vật có lợi trong đất [21]. Bên cạnh đó, còn có nấm Trichoderma harzianum được ứng dụng để kiểm soát tuyến trùng ký sinh thực vật khá hiệu quả. Windham và cộng sự (1989) đã tiến hành xử lý đất với nấm Trichoderma harzianum và Trichoderma koningii, sau đó trồng ngô kết quả cho thấy ở các lô thí nghiệm đã làm giảm quá trình sinh trứng của tuyến trùng nốt rễ Meloidogyne arenaria so với đối chứng [18]. Ngoài ra, nấm Trichoderma harzianum còn làm tăng sức đề kháng của cây trồng, một số chủng Trichoderma
harzianum có thể xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống chịu của cây trồng.
Hơn nữa đây đều là những hợp chất không làm ảnh hưởng đến những vi sinh vật có lợi trong đất và cũng được dùng để phòng ngừa nấm bệnh rất hiệu quả.
3.4 Thử nghiệm hiệu quả phòng trừ tuyến trùng bƣớu rễ của chế phẩm NemaITB ở điều kiện vƣờn ƣơm
Từ những kết quả thu được ở phòng thí nghiệm, tiến hành đánh giá hiệu quả tác động của chế phẩm ở điều kiện nhà lưới đối với cây hồ tiêu giâm hom (tại vườn ươm của Viện Sinh học nhiệt đới). Thí nghiệm được tiến hành như đã mô tả ở mục 2.2.17 phần Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu. Kết quả được ghi nhận như sau:
Bảng 3.3 Tỷ lệ rễ bị bướu, chiều cao tăng trưởng và số lượng tuyến trùng sau 30 và 60 ngày lây 800 ấu trùng cảm nhiễm tuổi 2 trên cây hồ tiêu giâm hom
Stt Nghiệm thức
Chỉ tiêu theo dõi Chiều cao
tăng trưởng của tiêu giâm
hom (%) Tỷ lệ rễ bị nhiễm bệnh (%) Số con cái/g Túi trứng/g Số lượng tuyến trùng/50g đất
Sau 30 ngày lây nhiễm
1
ĐC trắng (không lây nhiễm tuyến
trùng) 7,5 0 0 0 0 2 ĐC (có lây nhiễm) 2,4 69 18 5 820 3 NemaITB 0,5% 15,2 31 7 3 450 4 NemaITB 1% 18,0 18 3 4 280 5 NemaITB 2% 25,5 14 6 2 425
Sau 60 ngày lây nhiễm
9
ĐC trắng (không lây nhiễm tuyến
trùng) 28,5 0 0 0 0 10 ĐC (có lây nhiễm) 9,0 65,4 12 13 750 11 NemaITB 0,5% 85,0 8,6 9 4 250 12 NemaITB 1% 93,5 7,3 8 5 300 13 NemaITB 2% 99,5 5,6 5 2 480
Kết quả ở bảng trên cho thấy ở thí nghiệm này hầu hết các nghiệm thức có bổ sung chế phẩm NemaITB thì cây đều sinh trưởng và phát triển tốt thể hiện qua chỉ số
tăng trưởng chiều cao của cây, hơn nữa ở các nghiệm thức có bổ sung chế phẩm sau một tháng trở đi nhận thấy cây phát triển mạnh, xanh tốt và mọc chồi mới rất nhiều. Giai đoạn đầu (sau 30 ngày lây ấu trùng cảm nhiễm tuổi 2) ở các nghiệm thức có bổ sung chế phẩm số lượng tuyến trùng trong đất đã giảm từ 2-3 lần so với đối chứng (820 con/50g đất) tùy thuộc vào nồng độ xử lý của chế phẩm.
Kết quả này cũng cho thấy giữa các nghiệm thức có sự khác biệt về chiều cao tăng trưởng, % rễ bị bướu và số lượng tuyến trùng ở ngày thứ 30 sau khi bổ sung chế phẩm. Tuy nhiên ở ngày thứ 60 thì chiều cao tăng trưởng của cây hồ tiêu giâm hom đã phát triển gấp nhiều lần so với đối chứng (9,0%), kể cả blank 28,5% (đối chứng trắng, không lây ấu trùng cảm nhiễm tuổi 2). Trái lại, ở giai đoạn này % số rễ bị nhiễm đã giảm nhiều lần so với giai đoạn đầu và đối chứng (65,4%).
Kết quả này có thể được giải thích như sau: chế phẩm NemaITB được làm từ neem nên rất giàu hoạt chất sinh học (điển hình là azadirachtin) và chất hữu cơ do đó ngoài khả năng cung cấp dưỡng chất cần thiết cho cây hồ tiêu sinh trưởng và phát triển tốt, các hoạt chất sinh học còn giúp ngăn ngừa thậm chí diệt không những đối với nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật mà còn cả tác nhân vi sinh vật gây bệnh vùng rễ khác.
Hình 3.2 Cây hồ tiêu giâm hom 5 tháng tuổi
Hình 3.4 Tuyến trùng bướu rễ cái (x40)
Hình 3.6 Ấu trùng cảm nhiễm tuổi 2
3.5 Sơ bộ đánh giá hiệu quả phòng ngừa tuyến trùng bƣớu rễ cây hồ tiêu của chế phẩm NemaITB tại Ấp Bầu Trƣ, xã An Bình (Phú Giáo, Bình Dƣơng) chế phẩm NemaITB tại Ấp Bầu Trƣ, xã An Bình (Phú Giáo, Bình Dƣơng)
Nhằm làm rõ vai trò cũng như hiệu quả của chế phẩm NemaITB chúng tôi đã kết hợp với hộ dân trồng tiêu ở ấp Bầu Trư (huyện Phú Giáo tỉnh Bình Dương) tiến hành thử nghiệm chế phẩm NemaITB trên vườn hồ tiêu 12 năm tuổi.
Địa điểm thử nghiệm:
- Ông Bùi Hải Truyền. Ấp Bầu Trư, Xã An Bình, huyện Phú Giáo, tỉnh Bình Dương. Vườn khoảng 100 nọc tiêu (giống tiêu Chung). Quy mô thử nghiệm: 40 nọc tiêu.
Chế phẩm NemaITB dạng bột được khuyến cáo sử dụng 100g/gốc tiêu trưởng thành. Cách bón như sau: Theo độ dốc của vườn tiêu, ở phía trên độ dốc cách 30 cm