- Xác định tổng Ca và Mg
Nguyên tắc: để xác định tổng Ca và Mg, thông thường người ta sử dụng phương pháp xác định độ cứng toàn phần của nước (độ cứng toàn phần của nước là tổng lượng muối bicarbonate, clorur, sulfat, nitrat, v.v. của chất khoáng). Nguyên tắc của phương pháp này là dùng Trilon B (EDTA C10H14N2O8Na2) để chuẩn độ và chất chỉ thị màu là Đen Eriochrom T (C20H12N2O7SNa).
Trong môi trường pH = 10 các ion Ca và Mg tác dụng với chất chỉ thị màu tạo thành phức hợp có màu đỏ tím. Nếu kí hiệu Đen Eriochrom T là NaHI thì có phản ứng: NaHI Na+ + HI2-.
Mg2+ + HI2- MgI- + H+ Xanh lam Đỏ tím
Chất phức hợp này kém bền hơn phức hợp của Ca và Mg với Trilon B. Do đó, khi dùng Trilon B chuẩn độ, Trilon B sẽ kết hợp với Ca và Mg để tạo thành hợp chất phức hợp bền hơn. Chất chỉ thị màu được phóng thích tự do và trở lại màu xanh lam. Nếu ký hiệu Trilon B là Na2H2Y2- thì có phản ứng: Na2H2Y2- 2Na+ + H2Y2-. MgI- + H2Y2- MgY2- + HI2- + 2H+ Đỏ tím Không màu Không màu Xanh lam
Hóa chất: dung dịch KCN 3%, dụng dịch đệm amonium pH 10 (cân 6,7 g NH4Cl + 30 ml nước cất, hòa tan, thêm 57 ml NH4OH và dẫn nước cất đủ 100 ml), NaOH 10%, dung dịch Trilon B 0.05N, chỉ thị Đen Eriochrom T, giấy đo pH.
Vô cơ hóa mẫu bằng cách acid sunfuric đậm đặc: Cân 1,0g mẫu đã sấy khô tuyệt đối và nghiền mịn (chính xác đến 0,002g) cho vào chén sứ, sau đó đem vô cơ hóa mẫu ở 5500C trong 4 giờ, để nguội. Sau đó thêm vào đó 5 ml HCl 3N đun sôi cách thủy 15 phút, làm lạnh thêm 25 ml HCl 0,5 N và chuyển vào bình định mức thêm nước cất vào đến 50 ml(gọi là dung dịch A).
Cách thực hiện: hút 20 ml dung dịch A cho vào bình tam giác 100 ml. Trung hòa dung dịch trong bình tam giác bằng NaOH 10% và cho 4ml dung dịch đệm amonium đến đổi màu giấy quỳ tím. Tiếp theo, nhỏ vào bình 5 giọt KCN 3% (để ngăn cản một số ion như Fe3+
, Fe2+, Cu2+, v.v. tác dụng với Trilon B). Sau đó thêm vào bình khoảng nửa hạt gạo chất chỉ thị đen Eriochrom T, dung dịch có màu đỏ tím, dùng dung dịch Trilon B có chuẩn độ cho đến khi chuyển sang màu xanh lam (a: ml Trilon B). Thể tích Trilon B 0.05N chuẩn độ dung dịch có giá trị tương đương với hàm lượng Ca và Mg.
Song song tiến hành chuẩn mẫu trắng (tương tự các bước được thực hiện như trên, chỉ thay dung dịch A bằng nước cất).
- Xác định hàm lượng Calcium
Nguyên tắc: dùng Trilon B xác định Calcium trong dung dịch mẫu với chỉ thị là Murexid (C8H5O6N5) trong môi trường có pH = 12. Ký hiệu chất chỉ thị Murexid là
H3I- trong môi trường pH = 12, H3I- có màu tím và khi kết hợp với Calcium tạo thành phức hợp có màu hồng:
H3I- + Ca2+ CaH3I+ Tím Hồng
Chất phức hợp của Ca với Murexid không bền bằng chất phức hợp tạo bởi Ca với Trilon B. Vì vậy, Trilon B này sẽ đẩy chất chỉ thị Murexid ra khỏi phức hợp với Ca để trở về dạng tự do có màu tím:
CaH3I+ + H2Y2- CaY2- + H3I- + 2H+ Hồng Tím
Hóa chất: dung dịch NaOH 10%, dung dịch KCN 3%, chỉ thị Murexid, dung dịch Trilon B 0.05N.
Cách thực hiện: hút 20 ml dung dịch A vào bình tam giác 100 ml. Thêm 2 ml dung dịch NaOH, 5 giọt KCN 3% và khoảng nửa hạt gạo chỉ thị Murexid. Chuẩn độ bằng dung dịch Trilon B 0.05N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím.
Song song tiến hành chuẩn mẫu trắng (tương tự các bước thực hiện như trên, chỉ thay dung dịch A bằng nước cất).
Tính kết quả:
1. Tính thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ tổng Ca và Mg trong 100g mẫu khô.
Gọi - v: thể tích dung dịch Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ mẫu tổng Ca và Mg.
- v0: thể tích dung dịch Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ mẫu trắng
- v: v – v0
V: thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ dung dịch mẫu tương đương với 100g mẫu khô tính bằng ml/100g mẫu khô.
V =
a v
(ml/g)
2. Tính thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ Ca trong 100g mẫu khô.
- V1: thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ - C: Độ nguyên chuẩn của dung dịch Trilon B
- a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu lấy để chuẩn độ
- 24,04: đương lượng của Calcium
- V1: thể tích Trilon B cần để chuẩn độ khi xác định lượng Calcium trong dung dịch mẫu tương đương với 1g mẫu khô.
Ta có: V1 =
a v1
Lượng Calcium (tính bằng mg) trong 100g mẫu khô là:
m1 =
a xCx V1 20,04
Lượng Magnesium (tính bằng mg) trong 100g mẫu khô là:
m2 = (V – V1)xCx12,16
12,16: đương lượng gam của Mg.
Cách tiến hành
-Huyền phù hóa mẫu và pha loãng:
Cân 10g chế phẩm cần khảo sát cho vào erlen chứa 90ml nước muối sinh lý đã được vô trùng, lắc đều ta được dịch pha loãng 10-1
.
Cho vào máy lắc trong 30 phút, tiếp tục pha loãng mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý ra các nồng độ 10-2
, 10-3, 10-4,...
- Trải và ủ : hút 100 l dịch ủ có độ pha loãng thích hợp vào đĩa petri đã chứa sẵn môi trường PGA. Dùng que thủy tinh trải đều dung dịch mẫu lên mặt thạch. Lật ngược đĩa petri, gói lại. Đặt ở tủ ấm 300C, thời gian từ 2-3 ngày. Thực hiện tương tự với các mẫu có các độ pha loãng khác nhau.
Đọc và tính kết quả:
Đếm số khuẩn lạc đã mọc trên đĩa petri. Ghi nhận các nồng độ pha loãng cho từ 10 – 100 khuẩn lạc/ đĩa. Tính số lượng tế bào nấm mốc/gam mẫu (cfu/g)
B = y x 10n
Trong đó:
B: số lượng tế bào nấm mốc có trong 1g mẫu y: số khuẩn lạc nấm mốc
n: số lần pha loãng
2.2.11 Phƣơng pháp chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ chế phẩm NemaITB [11]
Chuẩn bị dịch chiết
Cân 100 gram chế phẩm được nghiền và ngâm trong trong 200ml cồn 960
khoảng 4 giờ chiết lấy dịch, bỏ bã. Tiếp tục thêm 20ml cồn vào bã chế phẩm ngâm khoảng 4 giờ, chiết lấy dịch, bỏ bã (lặp lại 4 lần). Gom tất cả dịch thu được, trộn đều và đem cô quay chân không, thu dịch chiết và định mức đến 100ml, dịch này được xem như dịch nguyên chất (nồng độ 100%) dùng để khảo sát. Dịch chiết này được pha loãng 1, 10 và 30 lần với nước cất đã hấp khử trùng.
Ngâm khuấy với cồn Cô quay chân
960, 4 giờ x 5 lần không