Hóa chất Thể tích (àl) Nồng độ cuối cùng PCR Mastermix 2X 25 1X MgSO4 25mM 2.0 1.0 mM Primer BCR-b2-C 0.5 500 nM Primer BCR-a3-D 0.5 500 nM H20 khử Nuclease 16 Sản phẩm RT-PCR 6 Tổng thể tích 50
Chu kỳ nhiệt: B−ớc 1 (1x): 95 0C: 1 min B−ớc 2 (35x): 94 0C: 30 sec
65 0C: 1 min 72 0C: 1 min
L−u ý: Ngoài primer mồi phát hiện bệnh, để kiểm tra quá trình tách ARN,
trong mỗi lần chạy RT-PCR/PCR, chúng tơi cịn sử dụng cặp primer chứng để khuếch đại đoạn gen β-actin (ng−ời bình th−ờng và bệnh nhân đều có gen này). Điều kiện phản ứng giống nh− với cặp primer bệnh.
Điện di trên gel agarose 2% phát hiện ADN với các kích th−ớc sau:
Kiểu chuyển đoạn Kích th−ớc băng
P210 b3-a2 360 bp
P210 b2-a2 285 bp
P210 b3-a3 186 bp
P210 b2-a3 111 bp
2.2.2.2. Phân tích xác định gen BCR/ABL bằng kỹ thuật FISH.
Thực hiện cho 10 bệnh phẩm của 10 bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh đ−ợc chẩn đốn bằng ph−ơng pháp hình thái và hóa học tế bào. Mỗi bệnh nhân đ−ợc lấy 1ml máu ngoại vi có chống đơng bằng heparin. Các mẫu máu đ−ợc kiểm tra bằng xét nghiệm tế bào có nhiều tế bào ch−a tr−ởng thành, số l−ợng bạch cầu trên 80 G/l và bảo quản ở 40C cho đến khi thực hiện xét nghiệm FISH ( thời gian bảo quản khơng q 3 ngày). Trong đó:
+ 5 bệnh nhân thực hiện kỹ thuật FISH trực tiếp không qua nuôi cấy. + 5 bệnh nhân thực hiện kỹ thuật FISH có đối chiếu với kỹ thuật tế bào di truyền ( kỹ thuật nuôi cấy ngắn hạn không ding chất phân bào [61] ).
- Nguyên lý kỹ thuật FISH :
Cơ sở của kỹ thuật FISH là phản ứng lai ghép. Nguyên lý của phản ứng lai ghép dựa trên đặc điểm hố học của acid nucleic, đó là các thành phần bazơ của nucleotit có khả năng bổ sung cho nhau qua liên kết hydro : A và T luôn bổ sung nhau qua 2 liên kết hydro và G và C luôn luôn bổ sung nhau qua 3 liên kết hydro. Với đặc điểm hoá học này, phân tử ADN tồn tại trong tế bào d−ới hình thái ADN kép gồm có 2 chuỗi ADN đơn bổ sung cho nhau.
Liên kết hydro là một liên kết yếu. Ta có thể phá liên kết hydro bằng nhiệt độ cao hoặc bằng pH cao gần 12. Kết quả phá liên kết dẫn đến việc biến tính ADN tức là một phân tử ADN kép tách thành 2 chuỗi đơn. Số liên kết hydro càng nhiều đòi hỏi nhiệt độ càng cao để làm ADN biến tính hồn tồn. Đặc điểm của liên kết hydro là liên kết này dễ bị phá nh−ng cũng dễ nối lại đ−ợc. Cho nên lúc các điều kiện phản ứng quay trở lại bình th−ờng thì 2 chuỗi ADN đơn bổ sung gắn với nhau để hình thành ADN kép đ−ợc gọi là phản ứng lai ghép.
Kỹ thuật FISH sử dụng đầu dị là một đoạn ADN đặc hiệu có các nucleotit đ−ợc gắn các phân tử huỳnh quang. Biến tính ADN cho mẫu bệnh phẩm hình thành các đích đến. Sự bổ sung trình tự của đầu dị lên các ADN
đích trong q trình tái tạo cấu trúc kép của ADN sẽ tạo ra các tín hiệu huỳnh quang t−ơng ứng với từng phần đặc hiệu trên chuỗi kép ADN và đ−ợc phát hiện bởi kính hiển vi huỳnh quang với các màng lọc thích hợp [120].