- Giếng a: Sản phẩm PCR sau khi đ−ợc cắt bằng enzym HindIII:
30 24 80,0 + So sánh giữa BCR/ABL và NST Ph1 (bảng 3.7).
4.2 Gen hỗn hợp BCR/ABL và lơ xê mi hạt kinh
nhân lơ xê mi hạt kinh là tạo nên gen hỗn hợp BCR/ABL, thì nhiều nghiên cứu về cơ chế sinh bệnh về tỷ lệ mang gen đã đ−ợc công bố. Gen ABL là oneogene, khi có chuyển đoạn cấu trúc lại NST, gen này hoạt động tạo ra men protein kinase có hoạt tính cao hơn nhiều lần so với bình th−ờng. Hoạt tính cao của men này đã làm tăng hoạt động truyền tin về kích thích phân bào vì vậy tủy sẽ tăng sinh quá mạnh gây ra bệnh.
Các nghiên cứu phân tích gen ở bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh đã cho thấy hầu hết bệnh nhân đều có gen hỗn hợp BCR/ABL [23]. Heim cho rằng trong hàng ngàn bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh đ−ợc phân tích NST thì có khoảng 5% tr−ờng hợp không có NST Ph1. Trong 5% tr−ờng hợp này thì có tới 1/2 có gen BCR/ABL.
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.6 của chúng tôi cho thấy có 80% bệnh nhân có gen BCR/ABL, tỷ lệ này ch−a cao so với các nghiên cứu n−ớc ngoài, đặc biệt kết quả ở bảng 3.7 cho thấy có tr−ờng hợp bệnh nhân không có NST Ph1 nh−ng đã phát hiện đ−ợc gen bất th−ờng. Điều này có thể nói lên là có tr−ờng hợp có tổn th−ơng thực sự mà không phát hiện đ−ợc bằng ph−ơng pháp tế bào di truyền. Tr−ờng hợp tỷ lệ có gen ABL/BCR ch−a cao có thể do một số bệnh nhân ch−a điển hình. Thậm chí có tr−ờng hợp kết quả PCR âm tiính nh−ng vẫn có NST Ph1. Điều này thực chất là ch−a mâu thuẫn nhiều vì xét nghiệm PCR sử dụng một cặp mồi có thể không phát hiện đ−ợc do điểm cắt trên gen BCR khá khác nhau. Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng đã sử dụng hai cặp mồi t−ơng ứng với hai điểm cắt là b2 và b3 trên gen BCR. Tuy nhiên còn có thể có điểm cắt khác?
Kết quả ở bảng 3.9 cũng cho thấy những bệnh nhân có kết quả Ph1 âm là những bệnh nhân có số l−ợng bạch cầu thấp. Heim cũng cho rằng Ph1 th−ờng không phát hiện đ−ợc ở những bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh không điển hình [23].
Khouri I. Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện gen hỗn hợp BCR/ABL ở 29 bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh đ−ợc điều trị interferon, và lui bệnh hoàn toàn về
mặt tế bào di truyền (không tìm thấy NST Ph1). Kết quả xét nghiệm PCR ở những bệnh nhân này cho thấy tất cả còn tế bào mang gen bất th−ờng [29] theo Seckinger thì với kỹ thuật PCR có thể phát hiện dù tỉ lệ tế bào mang gen là 1/100.000 [51], trong khi đó kỹ thuật tế bào di truyền đòi hỏi phân tích với tỷ lệ tế bào mang gen > 1%. Tr−ờng hợp bệnh nhân của chúng tôi có số l−ợng bạch cầu máu không cao, có thể do ph−ơng pháp tế bào di truyền không thể phân tích nhiều tế bào, không phát hiện đ−ợc Ph1 (bệnh nhân số 22 bảng 3.9). Kết quả này cũng cho thấy −u điểm của kỹ thuật này và theo Blancato, Seckinger. thì ứng dụng PCR để tìm gen bệnh có ý nghĩa to lớn khi xác định bệnh tồn d− tối thiểu (minimal residual desease =MRD) [10], [51]. Và nh− vậy từ nay có thể sử dụng kỹ thuật PCR để xác định chính xác mức độ lui bệnh khi điều trị bệnh lơ xê mi hạt kinh.
So sánh tỷ lệ các điểm cắt trên gen BCR ở bảng 3 cho thấy hầu hết bệnh nhân có gen BCR bị cắt ở sau exon b3. Có một số bệnh nhân (6,67%) có hai quần thể tế bào có các điểm cắt khác nhau. Tỷ lệ bệnh nhân có điểm cắt gen BCR ở exon b2 là 10%. Theo Mantzourani thì những bệnh nhân có BCR bị cắt exon b3 là tiên l−ợng nặng [39]. Trong đề tài này chúng tôi ch−a so sánh về thời gian sống thêm của bệnh nhân ở các điểm cắt khác nhau, nh−ng tỷ lệ có điểm cắt b3 là không cao.
Sử dụng kỹ thuật FISH để phát hiện bất th−ờng gen BCR/ABL cho thấy : Phát hiện đ−ợc 8 tr−ờng hợp bệnh nhân có chuyển gen (gen bất th−ờng). Hình ảnh có mặt gen bất th−ờng, phát hiện ở nhân tế bào gian kỳ chứng tỏ có thể xác định đ−ợc ngay khi tế bào không phân chia.
Theo Blancato, kỹ thuật FISH có độ nhạy cao và đơn giản hơn các kỹ thuật PCR do không phải tách ADN và không phải điện di. Kỹ thuật FISH có thể đ−ợc áp dụng với tiêu bản NST metaphase, lúc này hình ảnh đầu dò gắn với NST sẽ đ−ợc phát hiện nhờ việc gắn chất phát hiện [10].
Kết quả phân tích FISH trên tiêu bản metaphase rõ ràng và dễ đọc và so với kết quả phân tích NST (bảng 10) cho thấy khi thực hiện đ−ợc nuôi cấy
tế bào và có hình ảnh NST Ph1 không điển hình có thể dùng kỹ thuật FISH metaphase để xác định. Mặc dù số bệnh nhân đ−ợc phân tích biến đổi ADN bằng kỹ thuật FISH ch−a nhiều nh−ng những kết quả đ−a ra cũng cho thấy có thể ứng dụng các kỹ thuật này trong việc chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh. Nh− vậy có thể nói, với lơ xê mi hạt kinh chúng ta có thể sử dụng các kỹ thuật khác nhau để phát hiện bất th−ờng vật chất di truyền là :
- Kỹ thuật tế bào di truyền phát hiện NST Ph1.
- Kỹ thuật FISH (interphase và metaphase) phát hiện bất th−ờng gen BCR/ABL.
- Kỹ thuật RT PCR để phát hiện gen BCR/ABL và các điểm cắt của gen BCR.
Các kết quả của một hay nhiều kỹ thuật xét nghiệm trên chắc chắn có giá trị trong chẩn đoán, theo dõi điều trị tiên l−ợng cho bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh.