nhận biết đặc hiệu với enzym giới hạn Bcli tại nucleotid số 99 với trình tự t↓gatca. Bình th−ờng, khi đ−ợc ủ với enzym giới hạn Bcli, Bcli sẽ cắt đoạn adn dài 142 bp thành hai đoạn nhỏ dài 99 bp và 43 bp - kết quả đ−ợc ghi nhận là d−ơng tính (+). Khi một trong các bazơ bị đột biến (c→t hoặc g→c) sẽ làm vị trí nhận biết của Bcli bị mất do đó khi ủ adn với Bcli thì adn sẽ không bị cắt. Trong tr−ờng hợp này, khi điện di trên gel polyacrylamid 10% hoặc low aragose 3%, các sản phẩm thu đ−ợc sau pcr- rflps với sự có mặt của Bcli cho thấy băng adn 142 bp vẫn giữ nguyên -
kết quả đ−ợc ghi nhận là âm tính (-).
+ Nguyên lí t−ơng tự nh− trên với pcr-rflps intron 19 với sự có mặt của enzym giới hạn Hindiii. Bình th−ờng đoạn adn dài 717 bp trên intron 19 của gen yếu tố viii sẽ đ−ợc cắt thành 3 băng là: 469, 167 và 81 bp - kết quả đ−ợc ghi nhận là d−ơng tính (+). Những tr−ờng hợp đột biến, vị trí nhận biết của Hindiii giữa băng 167- 81 bp sẽ mất vì vậy sản phẩm thu đ−ợc sau pcr-rflps sẽ là 2 băng là các băng 469 và 248 bp, kết quả đ−ợc ghi là âm tính (-).
- Quy trình kỹ thuật :
+ Bệnh phẩm: Mỗi đối t−ợng nghiên cứu đ−ợc lấy 2,5 ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.
+ Tách chiết adn bằng điện li giải và protenase k (tách chiết adn bằng plasmid):
2 ml máu chống đông bằng Edta đ−ợc trộn trong 6 ml đệm li giải hồng cầu. Cặn thu đ−ợc sau li tâm hòa trong 2 ml đệm li giải nhân tế bào có thêm 0.15 ml sds 10% và 0,35 ml proteinase K. Tủa protein đ−ợc loại bỏ bằng 0,64 ml NaCl bão hòa (6mM). Dịch nổi thu đ−ợc sau khi li tâm đ−ợc tạo tủa với 3ml isopropanol lạnh. Rửa tủa bằng 1ml 70% ethanol lạnh. Hòa tan tủa trong 100àl
đệm Tris-edta 10mM. Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu adn thu đ−ợc bằng đo quang phổ kế ở b−ớc sóng 260/280 nm và điện di trên thạch 0.8%.
+ phản ứng pcr:
phản ứng pcr đ−ợc thực hiện với thể tích 50àl gồm 47 àl đệm pcr (master mix), 1àl mồi xuôi, 1àl mồi ng−ợc, 1àl adn. ch−ơng trình chạy pcr theo trình tự:
- Bcli: [940c/30”, 500c/20”; 720c/20”] x 30 chu kì; - Hindiii: [940c/ 30”, 550c/ 20”, 720c/40”] x 30 chu kì
phản ứng đ−ợc thực hiện trên máy khuyếch đại gen. cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 (18F và 18R) đ−ợc thiết kế theo kogan và cộng sự (1987) và intron 19 (19F và 19R) đ−ợc thiết kế theo Graham (1990) [42].
- 18f : 5’-taaaagctttaaatggtctaggc-3’ - 18r : 5’- ttcgaattctgaaattatcttgttc-3’
- 19f : 5’- aaggtcctcgagggcgagcat-3’ - 19r : 5’- aaggtcggatccgtccagaag- 3’ - đa hình độ dài đoạn cắt enzym giới hạn (rflps):
sản phẩm pcr với cặp mồi 18f và 18r đ−ợc ủ cùng với Bcli ở 500
trong 12 giờ. sản phẩm pcr với cặp mồi 19f và 19r đ−ợc ủ cùng enzym giới hạn Hindiii ở 370c trong 12 giờ. sản phẩm sau rflps đ−ợc xác định thành phần bằng điện di trên gel polyacrylamid 10% trong đệm TBE 0,5x hoặc trên gel low aragose 3%. Các băng adn thu đ−ợc sau nhuộm bạc hoặc nhuộm ethidium bromide đ−ợc xác định kích th−ớc dựa trên thang adn chuẩn. [3]
vì gen yếu tố viii nằm trên nhiễm sắc thể x nên ở nam giới chỉ có 1 alen duy nhất do vậy kết quả pcr-rflps với Bcli và Hindiii ở nam giới sẽ có 1 trong 2 tr−ờng hợp xảy ra là: sau ủ với enzym, băng adn không bị cắt
[âm tính (-)] hoặc băng adn bị cắt [d−ơng tính (+)]. còn ở nữ giới vì có 2 alen nên sẽ có 3 tr−ờng hợp xảy ra:
+ băng adn của cả 2 alen đều bị cắt [đồng hợp tử d−ơng (+/+)],
+ hoặc băng adn của cả 2 alen đều không bị cắt [đồng hợp tử âm (-/-)],
+ hoặc chỉ có băng adn của 1 alen bị cắt còn của alen kia thì không bị cắt [dị hợp tử (+/-)]. Khi đó trên điện di sẽ có cả ba băng.
tỉ lệ dị hợp tử lí thuyết của alen đ−ợc tính theo công thức hardy - weiberg (trích dẫn từ [2]).
2.1.2.2. áp dụng pcr- rflps với Bcli xác định ng−ời mang gen bệnh trong gia đình bệnh nhân Hemophilia a: trong gia đình bệnh nhân Hemophilia a:
- Xác định ng−ời mẹ mang gen, và dị hợp tử ADN tại điểm cắt của BclI: trong số 40 gia đình bệnh nhân hemophilia a mà mẹ bệnh nhân đ−ợc phân tích Bcli kể trên có 22 mẹ chắc chắn là ng−ời mang gen (xác định bằng phân tích phả hệ: là con của bệnh nhân Hemophilia, đẻ hai con Hemophilia, hoặc đẻ một con Hemophilia và trong gia đình có ng−ời quan hệ huyết thống bị Hemophilia), trong đó có 12 ng−ời dị hợp tử .
- Phân tích đa hình của bệnh nhân, bố, mẹ và chị (em) bênhụ nhân để xác định ng−ời mang gen bệnh.
Trong số 12 ng−ời dị hợp tử có 9 ng−ời có con gái. Nh− vậy con gái là ng−ời nghi ngờ mang gen cần đ−ợc chẩn đoán xác định. Chúng tôi tiến hành lấy mẫu và phân tích dạng đa hình với điểm cắt của enzym Bcli ở những gia đình này (gồm bố, mẹ, bệnh nhân, chị em gái)
27 mẫu gồm 2ml máu tĩnh mạch, chống đông bằng edta từ 27 thành viên trong 9 gia đình này đã đ−ợc lấy và tiến hành pcr- rflps với
Bcli theo quy trình trên .
so sánh sự xuất hiện dạng đa hình ở bệnh nhân, bố, mẹ và ng−ời nghi ngờ để xác định là ng−ời có mang gen hay không.
- Đồng thời định l−ợng nồng độ yếu tố viii:c cho 7 đối t−ợng là chị em gái bệnh nhân (không có thai hoặc uống thuốc tránh thai) bằng ph−ơng pháp 1 thì, xét nghiệm đ−ợc thực hiện tại labo Đông cầm máu - viện huyết học - truyền máu tw.
2.2. Nghiên cứu bất th−ờng gen ở bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh
2.2.1. Đối t−ợng:
Gồm 40 bệnh nhân đ−ợc chẩn đoán xác định lơ xê mi hạt kinh dựa trên xét nghiệm tế bào máu và tuỷ x−ơng, đ−ợc theo dõi điều trị tại Viện Huyết học - Truyền máu trung −ơng và Khoa Huyết học - Truyền máu BV. Bạch Mai. Những bệnh nhân này đ−ợc xét nghiệm tế bào di truyền phát hiện NST Ph1 theo kỹ thuật nuôi cấy ngắn hạn do Verma giới thiệu [61].
- Thực hiện xét nghiệm RT- PCR cho 30 bệnh nhân. Thực hiện kỹ thuật FISH trên tiêu bản tế bào gian kỳ (interphase) cho 5 bệnh nhân, và trên tiêu bản NST kỳ giữa cho 5 bệnh nhân khác
2.2.2. Ph−ơng pháp nghiên cứu:
2.2.2.1. Phân tích xác định bất th−ờng gen BCR/ABL theo kỹ thuật PCR (Kỹ thuật RT PCR và Nested PCR )
Thực hiện cho các mẫu gồm 1,5 ml dịch tuỷ x−ơng hoặc 3ml máu ngoại vi của 30 bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh, bệnh phẩm đ−ợc chống đông bằng EDTA và bảo quản ở tủ - 200C không quá 30 ngày.
Quy trình kỹ thuật nh− sau: