- Giếng a: Sản phẩm PCR sau khi đ−ợc cắt bằng enzym HindIII:
30 24 80,0 + So sánh giữa BCR/ABL và NST Ph1 (bảng 3.7).
4.1.2. áp dụng PCR-RFLPs với BclI vào chẩn đoán ng−ời mang gen Hemophilia A:
[42]. Sự khác nhau này có thể có nguyên nhân là do sự khác biệt về chủng tộc ng−ời giữa hai nghiên cứu. Điều này gợi ý cần tiếp tục tìm hiểu về marker
Hind III sâu hơn nữa để có thể xem xét áp dụng vào việc chẩn đoán ng−ời mang gen hemophilia A tại Việt Nam.
4.1.2. áp dụng PCR-RFLPs với BclI vào chẩn đoán ng−ời mang gen Hemophilia A: Hemophilia A:
Trong số 22 ng−ời mẹ chắc chắn mang gen có 12 ng−ời có thông tin với BclI (chiếm tỉ lệ 55%) và phân tích 27 thành viên trong 9 gia đình đ−ợc xét nghiệm để chẩn đoán ng−ời mang gen.
Phân tích kết quả bảng 3.5.
Gia đình số 1:
- Ng−ời mẹ mang gen dị hợp tử (+/-). - Ng−ời bố d−ơng tính (+)
- Con trai bị bệnh d−ơng tính (+) - Con gái dị hợp tử (+/-)
Vì con trai bị bệnh nên alen (+) là alen mang gen bệnh. Do con trai chỉ nhận nhiễm sắc thể X từ mẹ nên alen (+) của mẹ là alen mang gen bệnh, alen (-) là alen bình th−ờng.
Con gái nhận 1 alen từ bố và 1 alen từ mẹ. ng−ời bố có alen (+) vì vậy alen (+) có nguồn gốc từ bố, alen (-) có nguồn gốc từ mẹ, alen này theo phân tích trên là alen bình th−ờng. Vậy con gái của gia đình này là ng−ời không mang gen bệnh Hemophilia A.
Phân tích gia đình thứ hai: Ng−ời con trai mang gen (-) nên alen (-) ở ng−ời mẹ là alen bệnh. Phân tích ng−ời bố và con gái thấy bố mang gen (-) và con gái đồng hợp tử alen âm (-/-). vì vậy một alen (-) nhận từ mẹ. Mà nh− phân
tích trên alen (-) ở ng−ời mẹ là gen bệnh và nh− vậy ng−ời con gái này là ngừoi mang gen.
Phân tích t−ơng tự có thể khẳng định gia đình 6 cũng t−ơng tự gia đình 2 có ng−ời con gái mang gen bệnh, còn các gia đình khác con gái không mantg bệnh Hemophilia A.
Kết quả ở biểu đồ 3.1. cho thấy ng−ời con gái III2 dù con của ng−ời mẹ mang gen bệnh nh−ng phân tích trên bảng 5 cho biết không mang bệnh.
Nh− vậy, trong số 9 ng−ời con gái của 9 gia đình hemophilia A có 2 ng−ời đ−ợc xác định là mang gen (ng−ời con gái ở gia đình số 2 và gia đình số 6) và 7 ng−ời đ−ợc xác định là không mang gen (ở các gia đình còn lại).
Trong số 9 ng−ời này có 1 ng−ời đang có thai và 1 ng−ời ở xa chúng tôi ch−a lấy đ−ợc mẫu. 7 ng−ời còn lại đ−ợc xét nghiệm định l−ợng yếu tố VIII:C. Kết quả: 2 ng−ời mang gen có nồng độ yếu tố VIII thấp là 40 % (con của gia đình số 2) và 47% (gia đình số 6), 5 ng−ời còn lại có nồng độ yếu tố VIII:C > 50 %, (kết quả đ−ợc trình bày ở bảng 3.5). Nồng độ yếu tố VIII ở ng−ời mang gen bệnh thấp hơn ng−ời bình th−ờng đó là nhận xét của nhiều tác giả [59]..
Theo kết quả phân tích ở bảng 3.5, có 2 ng−ời đ−ợc xác định mang gen bệnh, 7 ng−ời không mang gen trong số 9 ng−ời có khả năng mang gen đ−ợc chẩn đoán. Nh− vậy nếu thu thập đủ mẫu để phân tích thì khả năng chẩn đoán của PCR-RFLP với BclI sẽ là 100% ở những ng−ời có thông tin. Bên cạnh đó chúng tôi tiến hành định l−ợng yếu tố VIII: C cho những ng−ời này để có thông số tham khảo. Kết quả là có 5/5 mẫu của ng−ời không mang gen có nồng độ yếu tố VIII:C > 50%, đa số trong đó là nồng độ yếu tố VIII:C cao; Trong khi đó 2 mẫu của ng−ời đ−ợc chẩn đoán là mang gen có nồng độ yếu tố VIII:C thấp: 47% và 40%. Kết quả này phù hợp với lí thuyết là nồng độ yếu tố VIII:C của phụ nữ mang gen th−ờng thấp (chiếm khoảng 50%). Điều này chứng tỏ kết quả chẩn đoán của chúng tôi là đáng tin cậy.
Trong số 12 gia đình có thông tin với BclI có 3 gia đình chúng tôi ch−a thu thập đủ mẫu của các thành viên do điều kiện ở xa.
Nh− vậy, mặc dù còn một số hạn chế nh−: chỉ có thể áp dụng đ−ợc ở những gia đình có mẹ là ng−ời chắc chắn mang gen bệnh, cần phân tích mẫu máu của nhiều thành viên trong gia đình thì PCR-RFLPs với BclI là một ph−ơng pháp chẩn đoán tình trạng mang gen hemophilia A có hiệu quả, rẻ tiền và không quá phức tạp. Về nh−ợc điểm thứ hai đ−ợc nêu ở trên, đó là việc cần phân tích mẫu máu của nhiều thành viên thì trong một số điều kiện, đặc biệt là khi các thành viên trong gia đình sống xa về địa lí thì cũng là một khó khăn cần khắc phục. Một nghiên cứu ở Thái Lan đã chỉ ra rằng, mẫu máu để phân tích PCR-RFLPs có thể bảo quản ở nhiệt độ th−ờng trong vòng 10 ngày mà không ảnh h−ởng tới kết quả xét nghiệm [49]. Nh− vậy trong điều kiện ở xa, ng−ời cần xét nghiệm có thể nhờ y tế cơ sở lấy mẫu máu theo h−ớng dẫn và vận chuyển đến trung tâm xét nghiệm mà không cần phải có mặt trực tiếp. Bên cạnh đó, ph−ơng pháp còn cho phép khẳng định đ−ợc tình trạng mang gen của ng−ời phụ nữ, đây là một −u điểm nổi trội so với ph−ơng pháp chẩn đoán ng−ời mang gen bằng phân tích nồng độ yếu tố đông máu. Hơn nữa, bằng ph−ơng pháp này, thầy thuốc có thể sử dụng để chẩn đoán tr−ớc sinh cho thai nhi, một công việc có ý nghĩa nhân văn cao cả và là một phần quan trọng trong công tác điều trị dự phòng.
Tóm lại có thể thấy sử dụng quy trình: (1) xác định ng−ời mẹ mang gen bằng phân tích phả hệ, (2) tìm mẹ dị hợp tử với gen đa hình. Sau đó (3) xét nghiệm PCR, phân tích ADN đa hình với BclI ở bệnh nhân, bố và mẹ bệnh nhân và ng−ời cần xét nghiệm để xem ng−ời đó có mang gen bệnh hay không. Và với cách phân tích này có thể dùng các chỉ điểm đa hình khác nhau để phối hợp tìm ng−ời mang gen bệnh theo ph−ơng pháp này.