Tính tốn kết quả
Xây dựng đường tuyến tính giữa giá trị hấp thu và hàm lượng chất chuẩn của dung dịch chuẩn tại bước sóng 760 nm. Nội suy hàm lượng tổng polyphenol trong dịch mẫu chiết đã pha lỗng từ đường tuyến tính (Nội suy ra C)
Hàm lượng tổng polyphenol trong mẫu cao trích (mg/kg) tính theo cơng thức:
𝑋 =C × 10 × F mx(1−%H) Trích ly polyphenol Cao trích Cân Lên màu Đo độ hấp thụ Methanol Kết quả Pha loãng mẫu Nước cất Folin-Ciocalteu 20% Na2CO3 o T = 70oC t = 10 phút λ=760nm.
38 Trong đó:
X : Hàm lượng tổng polyphenol trong mẫu quy về lượng tương đương với chất chuẩn acid gallic (mg/kg);
C : Nồng độ polyphenol tính từ đường chuẩn (mg/L). F : hệ số pha loãng (từ dung dịch đã chiết 10mL). m : khối lượng cân của mẫu cao trích (g).
H : Độ ẩm trong cao trích.
2.3.2.2. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH ♦ Nguyên tắc ♦ Nguyên tắc
Các chất kháng oxy hóa sẽ trung hịa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen thông qua việc electron tự do của gốc DPPH bắt cặp với một electron từ chất chống oxy hóa và một nguyên tử hydro (tương đương hydrua) để tạo thành DPPH-H khử, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt. Giá trị mật độ quang OD càng thấp chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao (TCVN 11939:2017). Quy trình thí nghiệm Hình 2. 5. Quy trình xác định hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH. Phối trộn \ t= 30 phút Pha loãng theo tỷ lệ
Ủ Đo mật độ quang Kết quả 0.003 g mẫu λ=519 nm Ethanol 99% DPPH
39
Thuyết minh quy trình
Pha lỗng mẫu: Cân chính xác 0.003g mẫu cao trích cho vào ống hach cùng với 6mL
dung mơi ethanol và lắc đều. Sau đó tiến hành pha lỗng mẫu theo tỉ lệ như bảng bên dưới.
Ủ: Hỗn hợp được ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phịng
Đo độ hấp thu: Dịch cao trích được đo độ hấp thu ở bước song λ= 519nm
Nếu hoạt tính của mẫu thử mạnh ta sẽ thử tiếp ở các nồng độ thấp hơn 10; 5; 2; 1µg/mL.
Tính tốn kết quả
Khả năng ức chế gốc tự do của mẫu được tính theo cơng thức:
𝐼 (%) =𝐴𝐶− 𝐴𝑆
𝐴𝐶 × 100%
Trong đó:
AC - Gía trị mật độ quang của dung dịch mẫu. AS - Gía trị mật độ quang của dung dịch mẫu trắng.
2.3.2.3. Khả năng khử Nguyên tắc
Khả năng chống oxy hoá của một chất được xác định bằng cách sử dụng phương pháp FRAP và được thực hiện bằng máy đo quang phổ. Nguyên tắc của phương pháp xác định khả năng khử hoạt tính oxy hố sắt (FRAP) khơng dựa trên cơ chế chuyển đổi giữa các nguyên tử hydro mà dựa trên sự cho-nhận điện tử giữa các phân tử với nhau (Prior và cộng sự, 2005). Mẫu thử sẽ khử ion Fe3+ trong phân tử kali ferricyanid (K3[Fe(CN)6]) thành ion Fe2+ trong phân tử kali ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]). Khi bổ sung FeCl3, Fe3+ sẽ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành phức hợp ferris ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]3) màu xanh dương.
Phản ứng FRAP được tiến hành ở pH axit (pH=3.6) để duy trì khả năng hịa tan sắt, các phản ứng diễn ra ở pH thấp làm giảm khả năng ion hóa, thúc đẩy chuyển nguyên tử hydro giữa các phân tử và tăng thế oxy hóa khử.
40
Hình 2. 6. Quy trình khảo sát khả năng khử Fe3+.
Thuyết minh quy trình
Hoạt tính khử của cao trích được xác định theo phương pháp của Negi và cộng sự (2005). - Phối trộn: Cao trích (0.1; 0.5 và 1 mg) được phối trộn với 1.0 mL đệm phosphate
(KH2PO4/K2HPO4) 2.0 M, pH 6.6 và 1 mL potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6) 1%. - Ủ: 50oC trong 20 phút.
- Phối trộn lần 2: thêm 1 mL acid trichloroacetic (TCA) 10% vào hỗn hợp đã phối trộn
trước đó. - Ly tâm: 2000 vịng trong vịng 10 phút. Phối trộn Ủ Phối trộn Ly tâm Phối trộn Đo độ hấp thu Kết quả Cao trích TCA FeCl3 KH2PO4 /K2HPO K3Fe(CN Nước λ=700 nm
41
- Phối trộn lần 3: Lớp nổi lên phía trên của dung dịch (1 mL) được phối trộn với
- nước cất (1 mL) và (0.2 mL) ferric chloride (FeCl3) 0.1%.
- Mẫu đối chứng: làm tương tự nhưng khơng có ferric chloride (FeCl3) 0.1%.
- Đo độ hấp thu: bước sóng 700 nm.
2.3.2.4. Xác định hoạt tính enzyme tyrosinase Nguyên tắc
Trong môi trường đệm pH=6,8, enzyme tyrosinase sẽ chuyển hóa L-DOPA thành DOPAchrome có màu đỏ cam có độ hấp thu cực đại tại bước sóng λ max = 475 nm. Các mẫu khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase sẽ làm giảm họat tính xúc tác của enzyme dẫn đến cường độ màu sẽ bị giảm đi (Nirmal và cộng sự, 2009).
42
Hình 2. 7. Xác định hoạt tính enzyme tyrosinase.
Thuyết minh quy trình
Mẫu được hịa tan trong dung dịch đệm pH=6,8, cho 100 µL thể tích enzyme tyrosinase 300 U mL -1 ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ, cho thêm 1000 µL chất nền L-DOPA (1.5 mM) lắc đều đợi lên màu trong 7 phút. Sau đó đem dung dịch đo quang tại bước sóng = 475 nm.
Tổng thể tích của mẫu thử là 3000 μL. Trong q trình chuẩn bị mẫu thử, mỗi mẫu luôn được kiểm tra đối chứng bằng mẫu dung dịch blank có các nồng độ khác nhau phù hợp với từng mẫu thử. Các mẫu dung dịch blank sẽ chứa enzyme và một lượng dung dịch đệm tương ứng thay thế cho chất nền.
Mỗi mẫu cao trích sẽ được khảo sát ở 4 nồng độ khác nhau: 100; 50; 25; 10 µM. Mỗi nồng độ được lặp lại thí nghiệm 3 lần, từ số liệu thu được ta tính được 3 giá trị phần
V3 L enzyme V4 L dd L- Đo độ hấp thụ quang Ủ 30 phút Lắc đều đợi 7 phút V1 L mẫu V2 L đệm pH= 6.8 Kết quả
43
trăm ức chế (I%) ứng với từng nồng độ. Lấy trung bình 3 giá trị I % từ đó ta sẽ xác định được giá trị phần trăm ức chế của mỗi nồng độ khảo sát. Nếu hoạt tính của mẫu thử thấp hơn 10 µM thì sẽ được thử tiếp ở các nồng độ 10; 5; 2,5; 1 µM để tìm ra giá trị IC 50 .
Cơ sở để đánh giá khả năng ức chế của những mẫu khảo sát được so sánh với chất đối chứng dương. Trong nghiên cứu này, kojic acid được chọn làm chất đối chứng dương vì kojic acid là chất ức chế enzyme tyrosinase mạnh.
Hình 2. 8. Phân tử Kojic acid Phần trăm ức chế Tyrosinase được tính theo cơng thức: Phần trăm ức chế Tyrosinase được tính theo cơng thức:
Phần trăm ức chế (%) =A − B A x100
Trong đó:
A – Hoạt tính PPO của mẫu đối chứng B – Hoạt tính PPO trong dịch chiết
Enzyme được sử dụng là: Tyrosinase từ nấm có hoạt tính lớn hơn 1000 unit/9.31 mg solid. 2687 units/mg Solid.
2.3.3. Ứng dụng bảo quản tôm thẻ chân trắng 2.3.3.1. Xử lý ngâm tôm
Khảo sát tối ưu nồng độ ngâm tôm ở 1-3oC trong 8 ngày.Q trình khảo sát được thực hiện mơ phỏng theo quy trình của (Nguyễn Xuân Phương, 2006; Nguyễn Tiến Lực, 2016 và Okpala và cộng sự, 2014) với một số bước biến đổi phù hợp với đề tài nghiên cứu
44
Hình 2. 9. Quy trình khảo sát chất lượng tơm bảo quản.
Thuyết minh quy trình
Tôm nguyên liệu
Tôm nguyên liệu được thu nhận phải nguyên vẹn, cịn tươi sống và khơng có dấu hiệu biến đổi màu sắc, tôm tươi vận chuyển từ nơi mua đến nơi thực hành (trường ĐH Sư phạm Kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh).
Phân loại
Mục đích nhằm loại bỏ những con tơm khơng đủ tiêu chuẩn chế biến: như trạng thái (đầu, bụng, chân,…),màu sắc. Rửa Tôm Phân loại \ t= 15phút Rửa Ngâm dịch trích Để ráo Đóng gói Bảo quản lạnh
Kiểm tra chất lượng Dịch trích
Kết quả Nước cất
45
Sau khi lựa chọn phân loại (xử lý nguyên liệu), nguyên liệu được đưa qua khâu rửa. Ở giai đoạn này nhằm mục đích là loại trừ các tạp chất, bụi, đất cát bám xung quanh nguyên liệu, đồng thời làm giảm một lượng lớn vi sinh vật ở nguyên liệu (Lê Mỹ Hồng, 2005). Yêu cầu nguyên liệu sau khi rửa: Phải sạch, khơng bị dập nát, ít bị tổn thất chất dinh dưỡng (khi rửa tránh để nguyên liệu tiếp xúc với nước lâu) (Lê Mỹ Hồng, 2005).
Ngâm dịch trích
Tơm được ngâm trong phụ gia nhằm bảo vệ tôm hạn chế sự ảnh hưởng bởi các tác nhân bên ngoài, đồng thời cũng làm chậm các phản ứng hố học, vi sinh bên trong tơm. Tuỳ thuộc vào mục tiêu khảo sát mà có phụ gia cũng như liều lượng sử dụng khác nhau (theo các tỷ lệ đã tính tốn). Trong dịch ngâm tôm thay đổi các nồng độ sau: 0.1 (mg/ml); 0.5 (mg/ml); 1 (mg/ml); Sau khi bảo quản lạnh đông trong 8 ngày, tơm sẽ được chụp hình bằng máy ảnh kỹ
thuật số/điện thoại có độ phân giải cao ở giai đoạn trước và sau khi hấp sau đó hình ảnh sẽ được đánh giá.
Để ráo- Đóng gói
Sau thời gian ngâm mẫu theo yêu cầu, tôm được vớt lên để ráo sau đó cho vào các túi zip và hút chân khơng để chuẩn bị cho q trình bảo quản lạnh.
Bảo quản lạnh
Để tránh sự xâm nhập của vi sinh vật, tôm trước khi cấp đơng và sau khi đóng gói sẽ được xếp xen kẽ tôm/ đá theo tỷ lệ 1:2.
Theo điều kiện thí nghiệm các mẫu tơm sẽ được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 1-3oC trong thùng xốp với đá vẩy được thay liên tục 9-12 tiếng/ lần. Trong thời gian 8 ngày và được quan sát, kiểm tra ở các giai đoạn ngày thứ 0, ngày thứ 2, ngày thứ 4, ngày thứ 6 và ngày thứ 8.
2.3.3.2. Đánh giá sự hình thành điểm biến đen ở tơm (melanosis)
Tơm sau khi xử lý được đóng gói vào túi zip và bảo quản trong thùng xốp chứa đá vẩy trong 8 ngày. Hình ảnh của tơm được chụp bằng máy ảnh và được phân tích cho giá trị độ xám (mean gray value) bằng cách sử dụng phần mềm ImageJ. Sự phát triển biến đen trên tôm tỉ lệ nghịch với giá trị độ xám (Angel B. Encarnacion và cộng sự, 2012). Kết quả được ghi nhận vào ngày 0, 2, 4, 6, 8 của quá trình bảo quản. So sánh kết quả của các mẫu cao với mẫu tôm được ngâm nước cất.
46
% thay đổi tương đối= 100- 𝐴𝑥100 𝐵 Trong đó:
A: là giá trị trung bình của độ xám trung bình trên mẫu tơm khảo sát tại thời điểm khảo sát. B: là giá trị trung bình của độ xám trung bình trên mẫu tôm đối chứng vào ngày 0.
2.3.3.3. Xác định khả năng ức chế q trình oxy hóa lipid (sự hình thành peroxide) ở tơm (TBARS)
TBARS là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để đo lường mức độ peroxide hóa của lipid trong thực phẩm có chứa chất béo. TBARS trong các mẫu được xác định theo mô tả của Stewakul và Bauer (2001) với một số sửa đổi. Thịt tôm xay (1 g) được trộn với 9 ml dung dịch HCl 0,25 N chứa 0,375% TBA và 15% TCA. Hỗn hợp được đun nóng trong nước sơi trong 10 phút, sau đó làm mát dưới vòi nước chảy. Hỗn hợp được ly tâm ở mức 4.000 vòng trong 20 phút bằng máy ly tâm. Thu phần dung dịch bên trên và đo độ hấp thụ được ở bước sóng 532nm bằng máy quang phổ UV-Vis. TBARS được tính tốn dựa theo đường chuẩn của malonaldehyde (0 - 2 ppm) và được biểu thị bằng mg malonaldehyd / kg thịt tôm.
Giá trị TBARS được xác định bằng lượng mg MDA/kg thịt tơm:
𝑇 =(𝑉1+𝑉2)×𝑎
𝑚 (2.9)
Trong đó:
T – giá trị TBARS (mgMDA/kg thịt tơm) V1 – thể tích dung dịch TCA 7,5% đã dùng (mL) V2 – thể tích dung dịch TBA 0,02M đã dùng (mL)
a – nồng độ tương đương tính được từ đường chuẩn (µg/mL) m – khối lượng thịt tơm (g)
47
Sơ đồ quy trình
Hình 2. 10. Quy trình khảo sát khả năng ức chế q trình oxy hóa lipid.
- Điều chế dung dịch HCl 0,25 N chứa 0,375% TBA và 15% TCA. Hút 9ml được điều chế
trộn với 1g thịt tôm xay.
- Đun hỗn hợp trong nước sôi 10 phút. Sau đó làm mát dưới vịi nước chảy. - Tiến hành ly tâm hỗn hợp ở mức 4000 vòng trong 20 phút bằng máy ly tâm.
- Thu phần dung dịch bề mặt và đo độ hấp thụ được ở bước sóng 532nm bằng máy quang
phổ UV-Vis.
2.3.3.4. Xác định sự thay đổi pH trong quá trình bảo quản
Giá trị đo pH được thực hiện theo phương pháp của Lopez-Caballero và cộng sự (2007) với một số biến đổi phù hợp với điều kiện thí nghiệm thực tế. Cân 10g thịt tơm để
1g thịt tôm xay Lắc đều 9ml HCL 0.25N (0.375% TBA, 15% TCA) to= 100oC t= 10 phút f=4000 vịng t=20 phút Đun nóng Làm mát Ly tâm Đo mật độ quang Kết quả λ=532nm
48
đồng hoá với 20ml nước cất trong thời gian 1 phút. Hỗn hợp sau đồng hoá được giữ ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đó đo giá trị pH bằng pH kế.
2.3.3.5. Xác định chỉ tiêu về vi sinh
Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí
Tổng số vi sinh vật hiếu khí được xác định theo TCVN 4884-1:2015 (ISO 48331:2013). Lượng quy định của mẫu thử dạng lỏng hoặc lượng quy định của huyền phù ban đầu trong trường hợp các sản phẩm ở dạng khác, được rót vào đĩa Petri và trộn với mơi trường nuôi cấy thạch tan chảy quy định. Chuẩn bị các đĩa khác dưới cùng một điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu. Các đĩa được ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30 °C trong 72 h.
Định lượng vi khuẩn kỵ khí khử Sunfite ở 46oC
Định lượng vi khuẩn kỵ khia khử Sunfite ở 46oC theo phương pháp NF V 08- 061:2009 (VF). Chọn lọc các bào tử trong mẫu bằng cách đun nóng trong một khoảng thời gian đủ để tiêu diệt các vi khuẩn dinh dưỡngLọc mẫu nước qua màng lọc có kích thước lỗ sao cho các bào tử vi khuẩn (0,2 mm) được giữ lại trên màng lọc. Đặt màng lọc vào môi trường nuôi cấy chọn lọc xác định (thạch sắt sunphit), tiếp theo ủ ở 46oC ± 1oC trong 20 ± 4h và 44 ± 4hvà đếm các khuẩn lạc có màu đen.
Đinh lượng trực khuẩn mủ xanh( Pseudomonas aeruginosa)
Đinh lượng Pseudomonas aeruginosa được xác định theo TCVN 7138:2013 (ISO
13720:2010).Sử dụng phương pháp cấy đếm Pseudomonas aeruginosa trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt, sau khi ủ ấm ở nhiệt độ 25oC trong 44 ± 4 giờ. Khẳng định các khuẩn lạc Pseudomonas spp. bằng phép thử oxidase( dương tính).
2.3.3.6. Xác định tổng hàm lượng nitơ bazơ bay hơi - Total Volatile Basic Nitrogen (TVB-N)
Tổng hàm lượng nitơ bazơ bay hơi trong thịt tôm được xác định theo TCVN 9215- 2012. Các nitơ bazơ bay hơi có trong mẫu được chiết bằng dung dịch axit percloric. Sau khi được kiềm hóa, dịch chiết được chưng cất bằng hơi nước và các thành phần nitơ bazơ bay hơi được hấp thụ trong bình chứa axit. Chuẩn độ các nitơ bazơ đã hấp thụ bằng dung dịch axit clohydric chuẩn. Kết quả được biểu thị bằng mg N/100 g thịt.
49
2.4. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu trung bình, độ lệch chuẩn và sai số bằng phần mềm Excel 2016 (Microsoft Inc, Redmond, California, USA).
Phân tích phương sai ANOVA được thực hiện bằng phần mềm SPSS (SPSS 20 for windows, SPSS Inc, Chicago, IL, 224 USA) với kiểm định đa khoảng Ducan (Ducan’s Multiple Range Test) (p ≤ 0,05) để phân tích sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị.
Phân tích hình ảnh bằng phần mềm ImageJ (Image Processing and Analysis in Java) (2012 version, National Institute of Health, USA).
50
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Điều chế cao trích 3.1. Điều chế cao trích
Trích ly các hợp chất từ bột hạt me(1kg) bằng phương pháp chiết ngâm dầm với methanol. Dịch trích được thu hồi dung mơi ở áp suất thấp để thu được cao trích methanol thơ (214,3 g). Phần cao methanol(100,2g) thô được phân tán vào một lượng nhỏ nước để tạo dịch sệt rồi tiến hành trích lỏng –lỏng lần lượt với các dung mơi ethyl acetate và nước. Các phần dịch trích được thu hồi dung mơi ở áp suất kém, thu được các loại cao tương ứng là cao methanol (214,3g), cao ethyl acetate (18,97 g) và cao nước (71,74 g).
Hiệu suất q trình trích ly bằng phương pháp ngâm dầm với dung môi methanol và phương pháp trích ly phân đoạn với dung mơi ethyl acetate từ hạt me được trình bày trong
Bảng 3. 1. Khối lượng và thu suất các loại cao các điều chế từ hạt cây T.indica.
STT Ký hiệu Mẫu Khối lượng (g) Thu
suất(%)
1 Nguyên liệu bột hạt me 1000 -
2 M-ME Cao methanol 214,3 21,41