3.1. Điều chế cao trích
Trích ly các hợp chất từ bột hạt me(1kg) bằng phương pháp chiết ngâm dầm với methanol. Dịch trích được thu hồi dung mơi ở áp suất thấp để thu được cao trích methanol thơ (214,3 g). Phần cao methanol(100,2g) thô được phân tán vào một lượng nhỏ nước để tạo dịch sệt rồi tiến hành trích lỏng –lỏng lần lượt với các dung mơi ethyl acetate và nước. Các phần dịch trích được thu hồi dung mơi ở áp suất kém, thu được các loại cao tương ứng là cao methanol (214,3g), cao ethyl acetate (18,97 g) và cao nước (71,74 g).
Hiệu suất q trình trích ly bằng phương pháp ngâm dầm với dung môi methanol và phương pháp trích ly phân đoạn với dung mơi ethyl acetate từ hạt me được trình bày trong
Bảng 3. 1. Khối lượng và thu suất các loại cao các điều chế từ hạt cây T.indica.
STT Ký hiệu Mẫu Khối lượng (g) Thu
suất(%)
1 Nguyên liệu bột hạt me 1000 -
2 M-ME Cao methanol 214,3 21,41
3 M-EA Cao ethyl acetate 40,57 4,06
4 M-CA Cao nước 153,43 15,34
Bột hạt me được trích ly bằng nhiều dung mơi khác nhau có độ phân cực tăng dần. Từ bảng 3.1, cho thấy hiệu suất trích ly của dung môi methanol (21,41%) cao hơn so với ethyl acetate (4,06%) và nước (15,34%). Điều này phù hợp với nghiên cứu của của Abdille và cộng sự (2005) đã cho thấy hiệu suất trích ly của dung môi methanol cao hơn so với các dung mơi khác. Ngồi ra, dung môi methanol đã được chứng minh là dung mơi hiệu quả để trích ly các hợp chất phenolic (Siddhuraju & Becker, 2003). Ngoài ra, sự khác nhau về hiệu suất trích ly là do tính chất dung mơi và phương pháp sử dụng bởi vì các quá trình này diễn ra trong cùng điều kiện về nhiệt độ, nguyên liệu, thời gian trích ly
3.2. Xác định hoạt tính chống oxy hố 3.2.1. Tổng hàm lượng polyphenol
51
Nghiên cứu của Velioglu và cộng sự (1998) đã chỉ ra rằng các hợp chất phenolic ở thực vật có khả năng chống oxy hóa và loại bỏ gốc tự do một cách hiệu quả. Do đó, thực nghiệm xác định hàm lượng của một số hợp chất phenolic trong cao trích đã được tiến hành để đánh giá mối tương quan giữa tổng hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu. Tổng hàm lượng polyphenol từ mẫu cao trích thơ và các mẫu cao phân đoạn được xác định dựa trên phương pháp so màu bằng thuốc thử Folin Ciocalteu.
Kết quả phân tích hàm lượng polyphenol (mg GAE/g chất khơ) của 3 mẫu cao trích được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3. 2.Tổng hàm lượng polyphenol từ mẫu cao trích hạt me.
STT Kí hiệu Tên mẫu Tổng hàm lượng polyphenol (mg GAE/g)
1 M-ME Cao methanol 365,37±7,90a
2 M-EA Cao ethyl acetate 221,51±11,2b
3 M-CA Cao nước 125,35±4,70c
Dữ liệu được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-c) thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về tổng hàm lượng polyphenol của các mẫu cao theo kiểm định Tukey.
Kết quả thu được cho thấy sự thay đổi đáng kể (p < 0,05) trong tổng hàm lượng polyphenol của các mẫu cao trích hạt me. Nhìn chung, các mẫu cao có sự khác biệt về tổng hàm lượng polyphenol. Từ bảng 3.2, kết quả trên cho thấy tổng hàm lượng polyphenol của các mẫu là khá cao, nằm trong khoảng 125,35 đến 365,37 mg GAE/g. Trong đó, cao M-ME có tổng hàm lượng polyphenol cao nhất (365,37 mg GAE/g), tiếp theo là cao M-EA (221,51 mg GAE/g). Cuối cùng, mẫu có tổng hàm lượng polyphenol thấp nhất là M-CA (125,35 mg GAE/g).
Kết quả trên phù hợp với hàm lượng phenolic dao động từ 3,7 đến 309 mg GAE/g trong nghiên cứu của Razali, N. và cộng sự (2012) về tác động của các dung mơi có độ phân cực khác nhau lên khả năng trích ly hợp chất phenol từ lá, hạt và vỏ của cây T. indica. Ngoài ra trong các báo cáo gần đây, các nhà nghiên cứu đã đưa ra nhận định rằng hiệu suất trích ly của các hợp chất polyphenol là cao nhất khi được trích ly bằng dung mơi methanol ở vỏ và hạt lựu so với các dung môi như ethyl acetate và nước ( Negi, Jayaprakasha, & Jena, 2002;
52
Singh, Chidambara Murthy, & Jayaprakasha, 2002). Hàm lượng phenol được xác định theo cách này không phải là phép đo tuyệt đối về lượng hợp chất phenol có trong nguyên liệu, trên thực tế cần dựa trên khả năng khử hóa học của chúng so với axit tannic. Hơn nữa, việc chiết xuất các hợp chất phenol từ quả thường được thực hiện với dung môi methanol hoặc methanol trong nước (Amiot, Fleuriet, & Macheix, 1986; Antolovich, Prenzler, Robards, & Ryan, 2000). Nhìn chung, methanol là được coi là dung môi hiệu quả nhất trong việc chiết xuất chất chống oxy hóa từ bột hạt me. Điều này phù hợp với báo cáo của Yen, Wu, và Duh (1996) chỉ ra rằng methanol là một dung môi được sử dụng phổ biến và hiệu quả để trích ly các chất chống oxy hóa.
3.2.2. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH là một trong những phép phân tích để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro thường sử dụng nhất trong nghiên cứu, có đến 90% các nghiên cứu về chất kháng oxy hóa sử dụng phép phân tích này (P. Riley, 1997). Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hịa gốc DPPH• làm dung dịch chuyển từ màu tím sang vàng nhạt. Khả năng chống oxy hoá của pholyphenol tương ứng với mức độ đổi màu của hỗn hợp (Kalpna và cộng sự, 2011). Bản chất của phương pháp DPPH là các chất chống oxy hóa phản ứng với gốc tự do làm đổi màu hỗn hợp từ α-α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (màu tím đậm) thành α-α-diphenyl-β-picrylhydrazine (màu vàng nhạt). Mức độ đổi màu cho biết khả năng thu gom gốc tự do của các chất chống oxy hóa có trong mẫu.
Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH (I%) và giá trị IC50 của 3 mẫu cao được trình bày trong bảng 3.3 dựa theo kết quả đo ở phụ lục 2.Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH (I%) và giá trị IC50 của 3 mẫu cao được trình bày trong bảng 3.3 dựa theo kết quả đo ở phụ lục.
53
Bảng 3. 3. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các mẫu cao trích hạt me.
Mẫu % Ức chế gốc tự do DPPH IC50 (µg/mL) 10µg/mL 25 µg/mL 50µg/mL 100 µg/mL M-EA 38.19±3.1a 53.24±1.3a 68.83±0.9a 90.89±0.3a 23.74 M-CA 24.39±0.8b 37.99±0.8b 60.09±0.6b 87.83±0.7b 41.19 1µg/mL 2.5 µg/mL 5.0 µg/Ml 10 µg/mL M-ME 20.22±0.7 38.73±0.2 59.56±1.8 88.42±0.0 4.25
Dữ liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-b) ở cùng một cột thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các mẫu cao theo kiểm định Tukey.
Từ bảng 3.3 cho thấy phần trăm ức chế gốc tự do của các mẫu cao trích tăng dần khi
nồng độ mẫu thử tăng dần. Tại nồng độ 100 µg/mL, mẫu M-EA có phần trăm ức chế trên
90%. Những mẫu cao trích có phần trăm ức chế gốc tự do càng cao thì giá trị IC50 càng thấp thể hiện khả năng kháng oxy hóa càng tốt. Dựa vào bảng 3.3, cho thấy mẫu M-ME có giá trị phần trăm ức chế lớn hơn 50% tại nồng độ 5 µg/ml cụ thể là IC50= 4,25 µg/ml. Mẫu cao M- EA và M-CA có giá trị phần trăm ức chế lớn hơn 50% tại nồng độ 50µg/ml với IC50 tương ứng lần lượt là 23,74 µg/ml và 41,19 µg/ml. Kết quả trên chứng tỏ cao M-ME là có hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH manh nhất. Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Siddhuraju (2007) đã đưa ra nhận định rằng methanol là một dung mơi tối ưu để trích ly các hợp chất chống oxy hóa có khả năng thu nhận gốc tự do.
Kết quả hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH ở phần này có sự tương quan với kết quả tổng hàm lượng polyphenol ở phần 3.2.1. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Wang (2010), tổng hàm lượng polyphenol, DPPH có tương quan đáng kể với nhau. Các hợp chất phenolic được trích ly từ hạt me đóng một vai trị quan trọng quyết định khả năng kháng oxy hóa với các gốc tự do.
3.2.3. Năng lực khử Fe3+
Trong trái cây chứa rất nhiều chất chống oxy hố khác nhau và rất khó để định lượng từng chất chống oxy hóa riêng biệt này. Phương pháp thường được sử dụng trong sàng lọc
54
khả năng oxy hoá của nguyên liệu là thử nghiệm năng lực khử-FRAP (Benzie IFF và cộng sự, 1996). Thử nghiệm FRAP cho phép xác định trực tiếp khả năng khử của mẫu nghiên cứu và đây là một trong những thông số quan trọng để đánh giá sự tương quan giữa khả năng chống oxy hóa của nguyên liệu và tổng hàm lượng polyphenol có trong mẫu (I.F. Benzie và cộng sự, 1996; A. Luximon-Ramma và cộng sự, 2005). Phương pháp này dựa trên khả năng khử Fe3+ thành Fe2+ của các chất chống oxy hóa có trong mẫu nguyên liệu. Sự thay đổi khả năng khử của 3 mẫu cao trích theo nồng độ được thể hiện trong bảng 3.4.
Bảng 3. 4. Độ hấp thu tại bước sóng 700nm của 3 mẫu cao trích hạt me.
Mẫu Độ hấp thu (A) tại các nồng độ EC50
(mg/mL) 0,01 mg/mL 0,05 mg/mL 0,1 mg/mL
M-ME 0,251 ± 0,009a 0,722 ± 0,025a 1,402 ± 0,049a 0,030
M-CA 0,184 ± 0,006b 0,304 ±0,009 b 0,504 ± 0,023b 0,101
M-EA 0,233 ± 0,004 c 0,683 ±0,025 c 1,339 ± 0,006c 0,033
Dữ liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-c) ở cùng một cột thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về khả năng khử của các mẫu cao theo kiểm định Tukey.
Theo chiều tăng nồng độ, giá trị mật độ quang của các mẫu cao trích tăng dần (sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê p<0,05) được thể hiện trong bảng 3.4. Khi so sánh giữa các cao trích với nhau trong cùng một nồng độ, mẫu M-ME thể hiện khả năng khử Fe3+ thành Fe2+ cao hơn so với các mẫu còn lại. Cụ thể tại nồng độ mẫu phản ứng cao nhất là 0,1 μg/mL, mẫu M-ME cho độ hấp thụ quang cao nhất (1,339 mg/mL) và có sự khác biệt đáng kể với các mẫu cịn lại trong khi mẫu M-CA có độ hấp thụ quang thấp nhất (0,504 mg/mL). Sự khác biệt về năng lực khử giữa các mẫu được thể hiện rõ rệt qua giá trị EC50 (mg/mL. Giá trị EC50 càng thấp thì mẫu có hoạt tính càng mạnh. Với nồng độ 0,030 mg/mL thì cao trích M- ME đã có thể ức chế được 50% gốc tự do, trong khi cao trích M-EA và M-CA có giá trị EC50 lần lượt là 0,033 mg/mL và 0,101 mg/mL. Dựa vào bảng 3.4, kết quả này cũng cho thấy rằng tất cả các mẫu cao trích đều có khả năng cho electron, trong đó mẫu cao M-ME có năng lực khử mạnh hơn hai mẫu còn lại.
Sự chênh lệch về năng lực khử là do khả năng làm giảm ion Fe2+ của các mẫu thử, nồng độ cao trích càng cao thì năng lực khử và hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh (Qin Yan
55
Zhu, 2002). Nghiên cứu của Adedapo và cộng sự (2009) cũng đã cho thấy rằng cao trích methanol có khả năng nhường proton H+, ức chế được gốc tự do.
Theo nghiên cứu của Adedapo và cộng sự (2009) thì hoạt tính chống oxy hóa của nguyên liệu càng mạnh khi hàm lượng polyphenol có trong ngun liệu đó càng cao. Ngồi ra, theo như kết quả nghiên cứu của Gordon (1990) thì hoạt tính chống oxy hóa của tác nhân khử được thể hiện thông qua khả năng phá vỡ các gốc tự do bằng phản ứng cho đi một nguyên tử hydro. Điều này cho thấy một mẫu có tính chất chống oxy hố càng mạnh thì sẽ có năng lực khử càng cao.
Các mẫu cao này có thể được sử dụng để làm chậm quá trình melanosis bằng cách khử DOPA-quinone thành DOPA. Kết quả làm cho quinone không thể chuyển thành hắc sắc tố và quá trình hình thành melanosis có thể bị chậm lại (Nirmal và cộng sự, 2011). Kết quả năng lực khử của các mẫu nghiên cứu phù hợp tới tổng hàm lượng polyphenol ở phần 3.2.1 trong việc ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hố của cao trích từ methanol, ethyl acetate và nước.
3.2.4. Xác định hoạt tính enzyme tyrosinase
Phần trăm ức chế enzyme PPO (I%) và giá trị IC50 của 3 mẫu cao được trình bày trong bảng 3.5 dựa theo kết quả đo ở phụ lục 4.
Bảng 3. 5. Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các mẫu cao trích hạt me.
Mẫu % Ức chế theo nồng độ IC50 (µg/mL) 5 µg/mL 10µg/mL 25 µg/mL 50 µg/Ml 100 µg/mL M- ME 19,2±0,9 a 25,50±0,5a 36,39±1,7a 54,73±1,3a 72,21±0,5a 48.197 M-EA 6,99±0,0b 13,69±0,5b 22,49±0,912 b 31,31±1,4b 49,24±0,5b >100 M-CA 4,43±0,5c 8,28±0.5c 18,639±0,513c 23,69±0,9c 37,57±1,8c >100
56
Dữ liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-c) ở cùng một cột thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về khả năng ức chế enzyme tyrosinase của các mẫu cao theo kiểm định Tukey.
Dựa vào kết quả bảng 3.5 cho thấy hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các mẫu nghiên cứu bị ảnh hưởng bởi nồng độ cao trích. Khả năng ức chế PPO của các mẫu tăng dần theo chiều tăng của nồng độ cao trích. Trong cùng một nồng độ, mẫu M-ME thể hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao hơn đáng kể so với các mẫu còn lại (p < 0,05). Giá trị IC50 càng thấp chứng tỏ hoạt tính của mẫu đó càng mạnh. Theo đó, mẫu M-ME có giá trị IC50 thấp nhất (48,197 μg/mL), điều đó có nghĩa mẫu M-ME là mẫu có hoạt tính ức chế enzyme mạnh nhất. Tiếp theo là các mẫu M-EA và M-CA đều có giá trị IC50 lớn hơn 100 μg/mL.
Theo nghiên cứu của Te-Sheng (2009) đã đưa ra nhận định các hợp chất polyphenol là nhóm có khả năng ức chế tyrosinase (polyphenol oxidase) lớn nhất cho đến thời điểm này. Điều đó phù hợp với kết quả rằng cao M-ME có khả năng ức chế mạnh hơn cao M-EA và M-CA và tương quan với kết quả tổng hàm lượng polyohenol ở phần 3.2.1.
Dựa trên kết quả từ phân tích thành phần hố học phần 3.4, trong thành phần cao trích methanol có quecertin đúng với kết quả đã công bố của Razali, N. và cộng sự, 2012. Theo nghiên cứu của Xie và cộng sự (2003) khi so sánh khả năng ức chế của các flavonoid thì quecertin được đánh giá có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất với giá trị IC50 < 50µM. Quercetin đã được chứng minh là có thể ức chế q trình oxy hóa enzyme L-DOPA bằng cách tạo phức vòng càng với đồng trong enzyme.
3.2.5. Phân tích thành phần hố học Phân tích thành phần hố học
Bằng phương pháp phân tích HPLC, một số hợp chất có trong cao trích từ hạt me được định danh và trình bày như bảng 3.6. Theo như kết quả thu được thì có tổng cộng 36 hợp chất được xác định trong cao trích methanol được điều chế từ hạt me bằng phân tích HPLC-EIS-MS. Các hợp chất phenolic trong cao trích methanol được điều chế từ hạt me bằng phân tích HPLC-EIS-MS có 4 hợp chất (Morin, Quercetin, Fisetin, Astragalin) là flavonoid.
57
Bảng 3. 6. Một số hợp chất có trong mẫu cao trích từ bột hạt me.
STT Tên thường gọi m/z CTPT CTCT
1 Quercetin 303,112 C15H10O7 2 Astragalin 447,184 C21H20O11 3 Butylparaben (Butyl 4- hydroxybenzoate) 195,1205 C11H14O3 4 Fisetin 287,0585 C15H10O6 5 Eriodictyol 289,9763 C15H12O6
58 6 Luteolin 287,0585 C10H5NO 7 Naringenin 273,9617 C8H10N4 O2 8 procyanidin B2 577,1348 C20H24N2O6 9 Campesterol 401,1419 C15H14N2O 10 Fipexide 387,1153 C20H11ClN2O4
59 11 Cefsumide 439,0776 C17H20N4O6S2 12 Carbenicillin 377,0856 C17H18N2O6S 13 proanthocyanidin 593,2739 C31H28O12 14 2',4'- Dihydroxyacetoph enone 153,0609 C8H8O3
60 15 Morin (2 ', 3,4', 5,7- pentahydroxyflavone) 303,147 C15H10O7
Trong những chất đã được định danh và trình bày ở trên thì hầu hết các hợp chất đều có chứa vịng phenol. Điều này có thể phần nào giải thích được hoạt tính chống oxy hố mạnh của cao trích từ bột hạt me. Ngồi ra cịn có các hợp chất flavonoid (Morin, Fisetin), các hợp chất này có thể tạo phức với Cu2+ - một kim loại nằm ở trung tâm hoạt động và cần cho hoạt động xúc tác tyrosinase bằng cách liên kết nhóm hydroxyl với ion Cu2+ (Donghyun Kim, 2006). Sự hiện diện của các hợp chất flavonoid, phenolic có thể đóng một vai trị thiết yếu trong hoạt động