Phần trăm ức chế Tyrosinase được tính theo cơng thức:
Phần trăm ức chế (%) =A − B A x100
Trong đó:
A – Hoạt tính PPO của mẫu đối chứng B – Hoạt tính PPO trong dịch chiết
Enzyme được sử dụng là: Tyrosinase từ nấm có hoạt tính lớn hơn 1000 unit/9.31 mg solid. 2687 units/mg Solid.
2.3.3. Ứng dụng bảo quản tôm thẻ chân trắng 2.3.3.1. Xử lý ngâm tôm
Khảo sát tối ưu nồng độ ngâm tơm ở 1-3oC trong 8 ngày.Q trình khảo sát được thực hiện mơ phỏng theo quy trình của (Nguyễn Xn Phương, 2006; Nguyễn Tiến Lực, 2016 và Okpala và cộng sự, 2014) với một số bước biến đổi phù hợp với đề tài nghiên cứu
44
Hình 2. 9. Quy trình khảo sát chất lượng tơm bảo quản.
Thuyết minh quy trình
Tơm ngun liệu
Tơm ngun liệu được thu nhận phải nguyên vẹn, cịn tươi sống và khơng có dấu hiệu biến đổi màu sắc, tơm tươi vận chuyển từ nơi mua đến nơi thực hành (trường ĐH Sư phạm Kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh).
Phân loại
Mục đích nhằm loại bỏ những con tơm khơng đủ tiêu chuẩn chế biến: như trạng thái (đầu, bụng, chân,…),màu sắc. Rửa Tôm Phân loại \ t= 15phút Rửa Ngâm dịch trích Để ráo Đóng gói Bảo quản lạnh
Kiểm tra chất lượng Dịch trích
Kết quả Nước cất
45
Sau khi lựa chọn phân loại (xử lý nguyên liệu), nguyên liệu được đưa qua khâu rửa. Ở giai đoạn này nhằm mục đích là loại trừ các tạp chất, bụi, đất cát bám xung quanh nguyên liệu, đồng thời làm giảm một lượng lớn vi sinh vật ở nguyên liệu (Lê Mỹ Hồng, 2005). Yêu cầu nguyên liệu sau khi rửa: Phải sạch, khơng bị dập nát, ít bị tổn thất chất dinh dưỡng (khi rửa tránh để nguyên liệu tiếp xúc với nước lâu) (Lê Mỹ Hồng, 2005).
Ngâm dịch trích
Tơm được ngâm trong phụ gia nhằm bảo vệ tôm hạn chế sự ảnh hưởng bởi các tác nhân bên ngoài, đồng thời cũng làm chậm các phản ứng hố học, vi sinh bên trong tơm. Tuỳ thuộc vào mục tiêu khảo sát mà có phụ gia cũng như liều lượng sử dụng khác nhau (theo các tỷ lệ đã tính tốn). Trong dịch ngâm tôm thay đổi các nồng độ sau: 0.1 (mg/ml); 0.5 (mg/ml); 1 (mg/ml); Sau khi bảo quản lạnh đơng trong 8 ngày, tơm sẽ được chụp hình bằng máy ảnh kỹ
thuật số/điện thoại có độ phân giải cao ở giai đoạn trước và sau khi hấp sau đó hình ảnh sẽ được đánh giá.
Để ráo- Đóng gói
Sau thời gian ngâm mẫu theo yêu cầu, tơm được vớt lên để ráo sau đó cho vào các túi zip và hút chân không để chuẩn bị cho quá trình bảo quản lạnh.
Bảo quản lạnh
Để tránh sự xâm nhập của vi sinh vật, tơm trước khi cấp đơng và sau khi đóng gói sẽ được xếp xen kẽ tơm/ đá theo tỷ lệ 1:2.
Theo điều kiện thí nghiệm các mẫu tôm sẽ được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 1-3oC trong thùng xốp với đá vẩy được thay liên tục 9-12 tiếng/ lần. Trong thời gian 8 ngày và được quan sát, kiểm tra ở các giai đoạn ngày thứ 0, ngày thứ 2, ngày thứ 4, ngày thứ 6 và ngày thứ 8.
2.3.3.2. Đánh giá sự hình thành điểm biến đen ở tôm (melanosis)
Tôm sau khi xử lý được đóng gói vào túi zip và bảo quản trong thùng xốp chứa đá vẩy trong 8 ngày. Hình ảnh của tơm được chụp bằng máy ảnh và được phân tích cho giá trị độ xám (mean gray value) bằng cách sử dụng phần mềm ImageJ. Sự phát triển biến đen trên tôm tỉ lệ nghịch với giá trị độ xám (Angel B. Encarnacion và cộng sự, 2012). Kết quả được ghi nhận vào ngày 0, 2, 4, 6, 8 của quá trình bảo quản. So sánh kết quả của các mẫu cao với mẫu tôm được ngâm nước cất.
46
% thay đổi tương đối= 100- 𝐴𝑥100 𝐵 Trong đó:
A: là giá trị trung bình của độ xám trung bình trên mẫu tơm khảo sát tại thời điểm khảo sát. B: là giá trị trung bình của độ xám trung bình trên mẫu tơm đối chứng vào ngày 0.
2.3.3.3. Xác định khả năng ức chế q trình oxy hóa lipid (sự hình thành peroxide) ở tơm (TBARS)
TBARS là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để đo lường mức độ peroxide hóa của lipid trong thực phẩm có chứa chất béo. TBARS trong các mẫu được xác định theo mô tả của Stewakul và Bauer (2001) với một số sửa đổi. Thịt tôm xay (1 g) được trộn với 9 ml dung dịch HCl 0,25 N chứa 0,375% TBA và 15% TCA. Hỗn hợp được đun nóng trong nước sơi trong 10 phút, sau đó làm mát dưới vịi nước chảy. Hỗn hợp được ly tâm ở mức 4.000 vòng trong 20 phút bằng máy ly tâm. Thu phần dung dịch bên trên và đo độ hấp thụ được ở bước sóng 532nm bằng máy quang phổ UV-Vis. TBARS được tính tốn dựa theo đường chuẩn của malonaldehyde (0 - 2 ppm) và được biểu thị bằng mg malonaldehyd / kg thịt tôm.
Giá trị TBARS được xác định bằng lượng mg MDA/kg thịt tơm:
𝑇 =(𝑉1+𝑉2)×𝑎
𝑚 (2.9)
Trong đó:
T – giá trị TBARS (mgMDA/kg thịt tơm) V1 – thể tích dung dịch TCA 7,5% đã dùng (mL) V2 – thể tích dung dịch TBA 0,02M đã dùng (mL)
a – nồng độ tương đương tính được từ đường chuẩn (µg/mL) m – khối lượng thịt tôm (g)
47
Sơ đồ quy trình
Hình 2. 10. Quy trình khảo sát khả năng ức chế q trình oxy hóa lipid.
- Điều chế dung dịch HCl 0,25 N chứa 0,375% TBA và 15% TCA. Hút 9ml được điều chế
trộn với 1g thịt tôm xay.
- Đun hỗn hợp trong nước sơi 10 phút. Sau đó làm mát dưới vịi nước chảy. - Tiến hành ly tâm hỗn hợp ở mức 4000 vòng trong 20 phút bằng máy ly tâm.
- Thu phần dung dịch bề mặt và đo độ hấp thụ được ở bước sóng 532nm bằng máy quang
phổ UV-Vis.
2.3.3.4. Xác định sự thay đổi pH trong quá trình bảo quản
Giá trị đo pH được thực hiện theo phương pháp của Lopez-Caballero và cộng sự (2007) với một số biến đổi phù hợp với điều kiện thí nghiệm thực tế. Cân 10g thịt tơm để
1g thịt tôm xay Lắc đều 9ml HCL 0.25N (0.375% TBA, 15% TCA) to= 100oC t= 10 phút f=4000 vịng t=20 phút Đun nóng Làm mát Ly tâm Đo mật độ quang Kết quả λ=532nm
48
đồng hoá với 20ml nước cất trong thời gian 1 phút. Hỗn hợp sau đồng hoá được giữ ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đó đo giá trị pH bằng pH kế.
2.3.3.5. Xác định chỉ tiêu về vi sinh
Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí
Tổng số vi sinh vật hiếu khí được xác định theo TCVN 4884-1:2015 (ISO 48331:2013). Lượng quy định của mẫu thử dạng lỏng hoặc lượng quy định của huyền phù ban đầu trong trường hợp các sản phẩm ở dạng khác, được rót vào đĩa Petri và trộn với mơi trường nuôi cấy thạch tan chảy quy định. Chuẩn bị các đĩa khác dưới cùng một điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu. Các đĩa được ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30 °C trong 72 h.
Định lượng vi khuẩn kỵ khí khử Sunfite ở 46oC
Định lượng vi khuẩn kỵ khia khử Sunfite ở 46oC theo phương pháp NF V 08- 061:2009 (VF). Chọn lọc các bào tử trong mẫu bằng cách đun nóng trong một khoảng thời gian đủ để tiêu diệt các vi khuẩn dinh dưỡngLọc mẫu nước qua màng lọc có kích thước lỗ sao cho các bào tử vi khuẩn (0,2 mm) được giữ lại trên màng lọc. Đặt màng lọc vào môi trường nuôi cấy chọn lọc xác định (thạch sắt sunphit), tiếp theo ủ ở 46oC ± 1oC trong 20 ± 4h và 44 ± 4hvà đếm các khuẩn lạc có màu đen.
Đinh lượng trực khuẩn mủ xanh( Pseudomonas aeruginosa)
Đinh lượng Pseudomonas aeruginosa được xác định theo TCVN 7138:2013 (ISO
13720:2010).Sử dụng phương pháp cấy đếm Pseudomonas aeruginosa trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt, sau khi ủ ấm ở nhiệt độ 25oC trong 44 ± 4 giờ. Khẳng định các khuẩn lạc Pseudomonas spp. bằng phép thử oxidase( dương tính).
2.3.3.6. Xác định tổng hàm lượng nitơ bazơ bay hơi - Total Volatile Basic Nitrogen (TVB-N)
Tổng hàm lượng nitơ bazơ bay hơi trong thịt tôm được xác định theo TCVN 9215- 2012. Các nitơ bazơ bay hơi có trong mẫu được chiết bằng dung dịch axit percloric. Sau khi được kiềm hóa, dịch chiết được chưng cất bằng hơi nước và các thành phần nitơ bazơ bay hơi được hấp thụ trong bình chứa axit. Chuẩn độ các nitơ bazơ đã hấp thụ bằng dung dịch axit clohydric chuẩn. Kết quả được biểu thị bằng mg N/100 g thịt.
49
2.4. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu trung bình, độ lệch chuẩn và sai số bằng phần mềm Excel 2016 (Microsoft Inc, Redmond, California, USA).
Phân tích phương sai ANOVA được thực hiện bằng phần mềm SPSS (SPSS 20 for windows, SPSS Inc, Chicago, IL, 224 USA) với kiểm định đa khoảng Ducan (Ducan’s Multiple Range Test) (p ≤ 0,05) để phân tích sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị.
Phân tích hình ảnh bằng phần mềm ImageJ (Image Processing and Analysis in Java) (2012 version, National Institute of Health, USA).
50
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Điều chế cao trích 3.1. Điều chế cao trích
Trích ly các hợp chất từ bột hạt me(1kg) bằng phương pháp chiết ngâm dầm với methanol. Dịch trích được thu hồi dung mơi ở áp suất thấp để thu được cao trích methanol thơ (214,3 g). Phần cao methanol(100,2g) thô được phân tán vào một lượng nhỏ nước để tạo dịch sệt rồi tiến hành trích lỏng –lỏng lần lượt với các dung mơi ethyl acetate và nước. Các phần dịch trích được thu hồi dung mơi ở áp suất kém, thu được các loại cao tương ứng là cao methanol (214,3g), cao ethyl acetate (18,97 g) và cao nước (71,74 g).
Hiệu suất q trình trích ly bằng phương pháp ngâm dầm với dung mơi methanol và phương pháp trích ly phân đoạn với dung mơi ethyl acetate từ hạt me được trình bày trong
Bảng 3. 1. Khối lượng và thu suất các loại cao các điều chế từ hạt cây T.indica.
STT Ký hiệu Mẫu Khối lượng (g) Thu
suất(%)
1 Nguyên liệu bột hạt me 1000 -
2 M-ME Cao methanol 214,3 21,41
3 M-EA Cao ethyl acetate 40,57 4,06
4 M-CA Cao nước 153,43 15,34
Bột hạt me được trích ly bằng nhiều dung mơi khác nhau có độ phân cực tăng dần. Từ bảng 3.1, cho thấy hiệu suất trích ly của dung mơi methanol (21,41%) cao hơn so với ethyl acetate (4,06%) và nước (15,34%). Điều này phù hợp với nghiên cứu của của Abdille và cộng sự (2005) đã cho thấy hiệu suất trích ly của dung mơi methanol cao hơn so với các dung mơi khác. Ngồi ra, dung môi methanol đã được chứng minh là dung môi hiệu quả để trích ly các hợp chất phenolic (Siddhuraju & Becker, 2003). Ngoài ra, sự khác nhau về hiệu suất trích ly là do tính chất dung mơi và phương pháp sử dụng bởi vì các quá trình này diễn ra trong cùng điều kiện về nhiệt độ, nguyên liệu, thời gian trích ly
3.2. Xác định hoạt tính chống oxy hố 3.2.1. Tổng hàm lượng polyphenol
51
Nghiên cứu của Velioglu và cộng sự (1998) đã chỉ ra rằng các hợp chất phenolic ở thực vật có khả năng chống oxy hóa và loại bỏ gốc tự do một cách hiệu quả. Do đó, thực nghiệm xác định hàm lượng của một số hợp chất phenolic trong cao trích đã được tiến hành để đánh giá mối tương quan giữa tổng hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu. Tổng hàm lượng polyphenol từ mẫu cao trích thơ và các mẫu cao phân đoạn được xác định dựa trên phương pháp so màu bằng thuốc thử Folin Ciocalteu.
Kết quả phân tích hàm lượng polyphenol (mg GAE/g chất khơ) của 3 mẫu cao trích được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3. 2.Tổng hàm lượng polyphenol từ mẫu cao trích hạt me.
STT Kí hiệu Tên mẫu Tổng hàm lượng polyphenol (mg GAE/g)
1 M-ME Cao methanol 365,37±7,90a
2 M-EA Cao ethyl acetate 221,51±11,2b
3 M-CA Cao nước 125,35±4,70c
Dữ liệu được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-c) thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về tổng hàm lượng polyphenol của các mẫu cao theo kiểm định Tukey.
Kết quả thu được cho thấy sự thay đổi đáng kể (p < 0,05) trong tổng hàm lượng polyphenol của các mẫu cao trích hạt me. Nhìn chung, các mẫu cao có sự khác biệt về tổng hàm lượng polyphenol. Từ bảng 3.2, kết quả trên cho thấy tổng hàm lượng polyphenol của các mẫu là khá cao, nằm trong khoảng 125,35 đến 365,37 mg GAE/g. Trong đó, cao M-ME có tổng hàm lượng polyphenol cao nhất (365,37 mg GAE/g), tiếp theo là cao M-EA (221,51 mg GAE/g). Cuối cùng, mẫu có tổng hàm lượng polyphenol thấp nhất là M-CA (125,35 mg GAE/g).
Kết quả trên phù hợp với hàm lượng phenolic dao động từ 3,7 đến 309 mg GAE/g trong nghiên cứu của Razali, N. và cộng sự (2012) về tác động của các dung mơi có độ phân cực khác nhau lên khả năng trích ly hợp chất phenol từ lá, hạt và vỏ của cây T. indica. Ngoài ra trong các báo cáo gần đây, các nhà nghiên cứu đã đưa ra nhận định rằng hiệu suất trích ly của các hợp chất polyphenol là cao nhất khi được trích ly bằng dung mơi methanol ở vỏ và hạt lựu so với các dung môi như ethyl acetate và nước ( Negi, Jayaprakasha, & Jena, 2002;
52
Singh, Chidambara Murthy, & Jayaprakasha, 2002). Hàm lượng phenol được xác định theo cách này không phải là phép đo tuyệt đối về lượng hợp chất phenol có trong nguyên liệu, trên thực tế cần dựa trên khả năng khử hóa học của chúng so với axit tannic. Hơn nữa, việc chiết xuất các hợp chất phenol từ quả thường được thực hiện với dung môi methanol hoặc methanol trong nước (Amiot, Fleuriet, & Macheix, 1986; Antolovich, Prenzler, Robards, & Ryan, 2000). Nhìn chung, methanol là được coi là dung môi hiệu quả nhất trong việc chiết xuất chất chống oxy hóa từ bột hạt me. Điều này phù hợp với báo cáo của Yen, Wu, và Duh (1996) chỉ ra rằng methanol là một dung môi được sử dụng phổ biến và hiệu quả để trích ly các chất chống oxy hóa.
3.2.2. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH là một trong những phép phân tích để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro thường sử dụng nhất trong nghiên cứu, có đến 90% các nghiên cứu về chất kháng oxy hóa sử dụng phép phân tích này (P. Riley, 1997). Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hịa gốc DPPH• làm dung dịch chuyển từ màu tím sang vàng nhạt. Khả năng chống oxy hoá của pholyphenol tương ứng với mức độ đổi màu của hỗn hợp (Kalpna và cộng sự, 2011). Bản chất của phương pháp DPPH là các chất chống oxy hóa phản ứng với gốc tự do làm đổi màu hỗn hợp từ α-α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (màu tím đậm) thành α-α-diphenyl-β-picrylhydrazine (màu vàng nhạt). Mức độ đổi màu cho biết khả năng thu gom gốc tự do của các chất chống oxy hóa có trong mẫu.
Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH (I%) và giá trị IC50 của 3 mẫu cao được trình bày trong bảng 3.3 dựa theo kết quả đo ở phụ lục 2.Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH (I%) và giá trị IC50 của 3 mẫu cao được trình bày trong bảng 3.3 dựa theo kết quả đo ở phụ lục.
53
Bảng 3. 3. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các mẫu cao trích hạt me.
Mẫu % Ức chế gốc tự do DPPH IC50 (µg/mL) 10µg/mL 25 µg/mL 50µg/mL 100 µg/mL M-EA 38.19±3.1a 53.24±1.3a 68.83±0.9a 90.89±0.3a 23.74 M-CA 24.39±0.8b 37.99±0.8b 60.09±0.6b 87.83±0.7b 41.19 1µg/mL 2.5 µg/mL 5.0 µg/Ml 10 µg/mL M-ME 20.22±0.7 38.73±0.2 59.56±1.8 88.42±0.0 4.25
Dữ liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-b) ở cùng một cột thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các mẫu cao theo kiểm định Tukey.
Từ bảng 3.3 cho thấy phần trăm ức chế gốc tự do của các mẫu cao trích tăng dần khi
nồng độ mẫu thử tăng dần. Tại nồng độ 100 µg/mL, mẫu M-EA có phần trăm ức chế trên
90%. Những mẫu cao trích có phần trăm ức chế gốc tự do càng cao thì giá trị IC50 càng thấp thể hiện khả năng kháng oxy hóa càng tốt. Dựa vào bảng 3.3, cho thấy mẫu M-ME có giá trị phần trăm ức chế lớn hơn 50% tại nồng độ 5 µg/ml cụ thể là IC50= 4,25 µg/ml. Mẫu cao M- EA và M-CA có giá trị phần trăm ức chế lớn hơn 50% tại nồng độ 50µg/ml với IC50 tương