- Tập huấn và định chuẩn cho cán bộ nghiên cứu về cách khám răng và
TÊN VI KHUẨN GÂY HÔI MIỆNG
2.2.5. Các bước tiến hành nghiên cứu
2.2.5.1. Lấy mẫu bệnh phẩm mảng bám lưỡi [62],[63]
- Lập danh sách 30 sinh viên theo tiêu chuẩn lựa chọn và lên lịch hẹn ngày lấy mẫu mảng bám lưỡi (MBL).
- Trước ngày hẹn, yêu cầu các sinh viên không ăn uống, vệ sinh răng miệng, dùng nước xúc miệng trong vòng 4 giờ trước khi lấy mẫu.
- Thời gian lấy mẫu: từ 11h30 - 12h30, thời điểm này các sinh viên vừa học xong, chưa ăn, chưa vệ sinh răng miệng.
- Mẫu MBL được lấy từ phía sau lưỡi theo các bước sau: + Yêu cầu sinh viên há miệng, dùng tay kéo lưỡi ra ngoài.
+ Dùng cây cạo lưỡi gỗ vô trùng cạo từ phía sau ra phía trước của bề mặt lưng lưỡi, thể tích mẫu khoảng 1ml.
+ Sau khi lấy xong, cho bệnh phẩm vào tuýp chứa dung dịch bảo quản bệnh phẩm trong mơi trường kỵ khí và chuyển tới Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương trong vòng 1 giờ.
2.2.5.2. Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn trên mảng bám lưỡi [21],[59]
Bệnh phẩm MBL được cấy trên 2 loại môi trường thạch máu và socola sử dụng hệ thống nuôi cấy kỵ khí tự động (VAC - Whiteley VA500 workstation, Anh). Sau khi vi khuẩn mọc, các khuẩn lạc được quan sát về hình thể, màu sắc và nhuộm Gram để đánh giá hình thể, tính chất bắt màu. Các khuẩn lạc được tách chiết ADN, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen 16S rRNA. Sản phẩm PCR được giải trình tự gen trực tiếp. Các kỹ thuật trên được thực hiện thường quy tại khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương.
2.2.5.3. Tách chiết ADN của các vi khuẩn
Quy trình tách chiết ADN được thực hiện theo mô tả trước đây [61]. Khuẩn lạc vi khuẩn được trộn đều với 300µl lysis buffer (100mM Tris-HCl
pH 8,0; 20mM Na2EDTA; 0.5 M NaCl, 10% SDS) và ủ ở nhiệt độ 700
C trong 10 phút. Protein được loại bỏ bằng hỗn hợp dung dịch Phenol: Chloroform: Iso-amyl alcohol (25:24:1). ADN được tủa bằng 1v/1v dung dịch Isopropanol và ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút. Cặn ADN được rửa lại bằng 500µl Ethanol 70% và làm khô ở nhiệt độ phịng, sau đó hịa lại trong 50µl H2O hoặc TAE buffer.
2.2.5.4. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) [61],[62]
Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm 12,5µl 2X KAPA2G Robust HotStart ReadyMix, 0,5µM Forward primer, 0,5µM Reverse primer, 5% DMSO, 50 ng ADN trong tổng thể tích phản ứng là 25µl. Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt như sau: biến tính 950
C - 15 phút, 35 chu kỳ 950
C - 1 phút, 580C - 30 giây, 720C - 30 giây, kết thúc 720
C - 10 phút. Trình tự primer 16S rRNA.