NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG
Dê, cừu ốm chết nghi mắc bệnh đậu dê, cừu trên đàn dê, cừu nuôi tại 3 tỉnh Khánh Hòa, Ninh Thuận, Đắc Lắc.
2.2. NGUYÊN LIỆU
Các biểu mẫu điều tra (mẫu phiếu điều tra xem phần phụ lục).
Mẫu kiểm tra: mẫu máu, vảy đậu của dê, cừu bệnh nghi nhiễm bệnh virus đậu dê, cừu.
Sinh phẩm: tế bào tinh hoàn, tế bào thận dê, cừu sơ cấp; phôi gà 11 ngày tuổi.
2.3. DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHẤT
Dụng cụ: chày cối sứ, micropipet, đầu típ các loại, panh, kéo, cốc thủy tinh, đĩa
petri, chai nuôi cấy, ống eppendorf … Thiết bị:
Máy ly tâm, Hettich, Germany Máy ly tâm lạnh
Máy voltex VWR
Máy luân nhiệt, model Techne TC – 512 Hệ thống điện di ngang, model MiniGel XL Bộ đọc điện di, Vilber Lourmat, France
Hệ thống chụp ảnh điện di, model Bio-print 1000/20 Lị vi sóng
Tủ ấm….
Các loại hóa chất, mơi trường: Dung dịch PBS – Glycerin 50% TBE 1X
Natri Pyruvat, natribicacbonat
Các loại kháng sinh (gentmycin, ampicllin...) Kháng nấm (fungizon, amphotericin)
Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM có bổ xung 5 – 10% huyết thanh bào thai bê
Các loại mơi trường, hóa chất phục vụ cho nuôi cấy tế bào Các loại hóa chất và mơi trường dùng trong phản ứng PCR:
o 100bp ladder o dNTP mix o Buffer
o Distiller Water o Taq polymeraza
o Bộ kit để chiết tách ADN tổng số (Qiamp ADN Mini Kit) o Primer
- P1: mồi xuôi 5’-TTT CCT GAT TTT TCT TAC TAT-3’ - P2: mồi ngược 5’-AAA TTA TAT AGC TAA ATA AC-3’
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phương pháp điều tra dịch tễ
Điều tra dịch tễ học bệnh đậu dê, cừu bằng phương pháp hồi cứu dựa vào phiếu
điều tra, kết hợp phỏng vấn thú y cơ sở và người chăn nuôi, khảo sát trực tiếp. Các số liệu thu thập được điền vào các chỉ tiêu điều tra trên phiếu điều tra.
Điều tra tổng thể
Tổng đàn dê, cừu Giống
Phương thức chăn nuôi: nuôi thả, bán chăn thả, nuôi nhốt Nguồn thức ăn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình thức chăn ni: trang trại, hộ gia đình Điều tra chi tiết
Số lượng dê, cừu theo tuổi
Bảng 2.1: Số lượng dê, cừu theo tuổi
Triệu chứng lâm sàng (TCLS): phỏng vấn người chăn ni về các TCLS có xảy ra trước thời điểm điều tra.
Bệnh tích
Thời gian bị bệnh: mùa khô, mùa mưa, không theo mùa Những biểu hiện triệu chứng bệnh tích khác
(Phiếu điều tra tình hình mắc bệnh đậu dê, đậu cừu – xem phụ lục 2)
Kết thúc đợt điều tra, các số liệu trong phiếu điều tra được tổng hợp lại và xây
dựng bảng biểu để phân tích đánh giá.
2.4.2. Phương pháp lấy mẫu
Thu thập bệnh phẩm: đối tượng lấy mẫu phải là các con vật đang trong thời kỳ nung bệnh hoặc đang phát bệnh (có hiện tượng sốt cao 40 – 410C, xuất hiện các nốt đậu ở da, sưng hạch lympho, chảy nước mắt, nước mũi và nước bọt, thở khó, kém ăn). Bệnh phẩm: virus đậu là virus hướng thượng bì nên bệnh phẩm thường lấy là các vảy mụn đậu ở trên da mỏng (vùng bụng, mặt,..), trên niêm mạc và dịch tiết ở các mụn nước chưa vỡ. Lấy 1 – 2g vảy mụn đậu của con vật bị bệnh nghi mắc bệnh đậu dê, cừu, càng vô trùng càng tốt và bỏ vào lọ có chứa 5ml mơi trường vận chuyển virus (glycerin đệm phosphat, pH = 7,6). Ở trường hợp bệnh cấp tính, sốt
Dê Cừu
Loại động vật
Tuổi điều tra
Đực Cái Đực Cái Ghi chú Sơ sinh đến < 3 tháng Từ 3 đến < 6 tháng Từ 6 - < 12 tháng Trên 12 tháng Cộng
không phát hiện thấy các tổn thương lâm sàng, hoặc có thể phát hiện thấy các tổn thương < 4 ngày: lấy 10ml máu toàn phần của con vật đưa vào ống có chất chống đơng chun dụng.
Các mẫu bệnh phẩm sau khi lấy từ gia súc nghi mắc bệnh đậu dê, cừu được cho vào dung dịch bảo quản đựng sẵn trong lọ thuỷ tinh dày có nút vặn. Trên mỗi lọ đựng bệnh phẩm dán nhãn ghi các nội dung:
o Số hiệu gia súc o Loại bệnh phẩm o Ngày lấy bệnh phẩm o Địa chỉ lấy
o Tên người lấy
Cho lọ đựng mẫu bệnh phẩm vào hộp thiếc theo tiêu chuẩn của tổ chức dịch tễ thế giới (OIE). Sau khi được vận chuyển về đến phịng thí nghiệm, bệnh phẩm được bảo quản ở - 800C cho đến khi dùng.
Lưu ý: trong số những con vật bị bệnh, cần chọn lọc những con có triệu chứng điển hình nhất để lấy mẫu, cần lấy đủ mẫu theo tiêu chuẩn về thể tích hay trọng lượng. Nên chụp ảnh con vật với các triệu chứng nghi bệnh.
2.4.3. Phương pháp xử lý mẫu Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu
Mẫu máu, vảy mụn đậu của dê, cừu ốm chết nghi mắc bệnh đậu dê, đậu cừu đã
thu thập.
Tách ADN
Chiết tách ADN bằng kit QIAamp ADN MiniKIT (hãng sản xuất Qiagen – Cat
No: 51106).
Dụng cụ: - Micropipet các loại 100, 200, 1000µl
- Đầu típ các loại tương ứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tube 1,5 ml (khơng có men ARNase, ADNse)
Hình 2.1. Quy trình tách chiết ADN từ vảy mụn đậu
Tiến hành:
Nguyên liệu: vảy mụn đậu của dê, hoặc cừu nghiền bằng chày cối sứ cùng dung dịch PBS tỉ lệ 1/10, để tách đồng hóa tế bào.
Ly tâm tách tế bào: ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút, trong 5 phút, lấy phần nước nổi, bỏ cặn, lọc qua màng lọc vơ trùng (0,45µl).
Phá vỡ tế bào: cho 20µl Qiagen protease vào đáy tube 1,5ml.
Thêm 200µl mẫu nốt mụn đậu đã chuẩn bị ở trên (hoặc mẫu máu) vào tube, trộn đều.
Cho 200µl dung dịch ALV vào tube 1,5ml (nếu để đơng thì phải làm cho tan giá hoàn toàn mới dùng).
Để ở nhiệt độ 560C trong 10 phút. Vảy mụn đậu Ly tâm tách tế bào Phá vỡ tế bào Loại bỏ protein tạp Thu ADN
Hòa vào dung dịch TE
Ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube.
Loại bỏ protein tạp: cho 200µl Ethanol 96% vào, vortex kỹ trong 15 phút, ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube.
Chuyển toàn bộ dung dịch trên sang cột lọc có tube chứa bên dưới. (chú ý: không để chạm, dính đầu pipet vào mép cột lọc).
Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút.
Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mớ i, vứt bỏ tube đựng có chứa n ước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW1vào cột lọc.
Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút.
Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứ a mới, vứt bỏ tube đựng có chứ a nước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW2 vào cột lọc.
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút.
Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứ a mới, vứt bỏ tube đựng có chứ a nước đã lọc. Thu AND: ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Chuyển cột lọc QIAam sang tube 1,5ml chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc.
Hịa vào dung dịch TE: cho 200µl dung dịch đệm TE vào cột lọc, để ở trong phòng 1 phút.
Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Giữ nguyên toàn bộ, vứt cột lọc QIAamp.
Bảo quản: đậy tube 1,5 ml, ghi số hiệu, bảo quản – 700C
2.4.4. Phương pháp PCR
Nguyên tắc của phản ứng
PCR là một phản ứng phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép ADN với sự tham gia của enzyme ADN – polymerase chịu nhiệt, có 2 đoạn ADN làm mồi và dùng các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi bổ sung với nó. Vì vậy, để khởi đầu quá trình tổng hợp ADN cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit. Đoạn này gắn với ADN khuôn tại điểm khởi đầu sao chép và được enzyme ADN – polymerase điều khiển tổng hợp một đoạn ADN đặc thù. Các sợi ADN mạch đơn làm khuôn được tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 900C ( 92 – 980C ) cho mạch xoắn kép bung ra.
Cả hai sợi ADN đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi (Primer) được cung cấp để bám vào vị trí tương ứng cho cả hai sợi. Trong (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu tại vị trí bám của mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài giới hạn giữa hai đoạn mồi này.
Độ dài sản phẩm của PCR có thể vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục ngàn cặp nucleotit. Như vậy sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại được nâng nhiệt thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới được tổng hợp, các sợi này sau đó cịn dùng tiếp cho chu kì tiếp theo bao gồm các bước gắn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn.
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lý thuyết ta sẽ có 2n bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi. Đó là một đặc điểm quan trọng của kỹ thuật PCR, dẫn đến kết quả là một đoạn ADN định trước được nhân lên với một số lượng lớn. Ví dụ sau 30 chu kỳ số lượng bản sao ADN của PCR sẽ là 1.073.741.824.
Các yếu tố cơ bản của phản ứng PCR [1],[2]
- Mồi: là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp chuyên biệt với đầu
5’ hay đầu 3’ của đoạn ADN cần khuếch đại. Mồi gồm có mồi xi và mồi ngược. Mồi xuôi là trình tự nucleotit bắt cặp với đầu 5’ của đoạn ADN cần khuếch đại. Tương tự, mồi ngược là mồi bắt cặp với đoạn 3’ của đoạn ADN khuôn mẫu.
- dNTPs (Deoxynucleotide triphosphat): là dung dịch gồm 4 thành phần deoxynucleotide (dATP, dTTP, dCTP, dGTP). Nồng độ sử dụng dung dịch dNTP sẽ tuỳ thuộc vào các điều kiện phản ứng chung.
- Enzyme ADN – polymerase: có vai trị kéo dài mạch mới bổ sung với mạch khuôn từ các mồi khởi đầu. Các enzyme ADN – polymerase hiện nay đều có tính chịu nhiệt, khơng bị huỷ ở nhiệt độ biến tính.
- Dung dịch đệm cho phản ứng PCR: bao gồm các thành phần sau: Tris HCl (pH 8.3), KCl, MgCl2 và gelatin. Thành phần và nồng độ dung dịch đệm sử dụng tuỳ thuộc vào loại ADN – polymerase sử dụng.
Dung dịch đệm có vai trị quan trọng trong việc tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP, kích hoạt vị trí hoạt động của enzyme ADN – polymerase. Dung dịch đệm có ảnh hưởng mạnh đến tính đặc hiệu và hiệu suất của phản ứng PCR.
Các bước tiến hành phản ứng PCR [11]
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ và mỗi chu kỳ gồm có ba bước:
Bước 1: Biến tính (Denaturation)
Được thực hiện ở nhiệt độ 90 – 980C trong 30 giây đến 1 phút thời gian lưu tương ứng khoản 30 giây đến 1 phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử ADN mạch kép bị tách ra (do liên kết hydro bị đứt), tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới.
Bước 2: Thực hiện phản ứng lai (Anealing)
Sau bước 1, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống và nhỏ hơn nhiệt độ Tm của mồi, vào khoảng 37 ÷ 680C và thời gian lưu là 30 giây đến một phút. Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với sợi khn. Mồi được tổng hợp hố học, có mồi ngược và xi. Người ta cịn có thể dựa vào trình tự nucleotide ở đầu 3’ của khuôn để tổng hợp mồi. Sau đó bổ sung ADN – polymerase để kéo dài mồi.
Bước 3: Tổng hợp mạch mới hay còn gọi là kéo dài (Extension).
Nâng nhiệt phản ứng lên 720C trong vài chục giây đến một phút để ADN – polymerase tổng hợp sợi mới. Trong thực tế, thời gian và nhiệt độ phản ứng phụ thuộc vào sợi ADN cần khuếch đại.
Kết thúc một chu kỳ từ một ADN kép mẹ tổng hợp hai sợi ADN kép con. Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25 đến 40 chu kỳ. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 720C trong khoảng 10 phút sao cho tất cả các sợi đơn xoắn lại và tạo nên sản phẩm của PCR. Sau đó hạ nhiệt độ 40C để bảo quản sản phẩm.
Hình 2.2. Các bước thực hiện phản ứng PCR
Đọc kết quả sản phẩm PCR [9],[11]
Sản phẩm của PCR được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose để phát hiện đa hình của các đoạn ADN đặc thù, hoặc các đoạn ADN bị thay đổi do các tác nhân nào đó (đột biến, tái tổ hợp). Nồng độ phần trăm agarose trong gel phụ thuộc vào kích thước phân đoạn ADN, thông thường người ta hay sử dụng gel agarose 0,7%. Trong trường hợp kích thước phân đoạn ADN nhỏ hơn 1kb người ta hay đổ gel 1, 1,5 hoặc 2%, tùy theo kích thước của nó nhỏ mức nào.
Nguyên tắc của kỹ thuật điện di [9],[11]
Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử người ta thường sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử ADN nguyên vẹn, ADN bị cắt hạn chế và ADN của sản phẩm PCR.
Trong một điện trường, các phân tử tích điện thuộc pha lỏng sẽ di chuyển về các cực. Vận tốc di chuyển của các phân tử tuỳ thuộc vào tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng của chính các phân tử này. Như vậy giữa các phân tử có cùng khối lượng, phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về cực ngược dấu nhanh hơn.
ADN là một phân tử tích điện âm vì vậy chúng có thể dịch chuyển qua bảng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) dưới tác dụng của điện trường. Trên cùng một bản gel có cùng một dòng điện những phân tử ADN khác nhau về
nhau sau một thời gian như nhau. Kích thước phân tử càng lớn thì sự di chuyển trên trên gel càng chậm. Vì vậy tuỳ theo kích thước phân tử và tuỳ theo mức độ cần phân tách mà người ta chọn loại gel và nồng độ gel thích hợp để dùng trong điện di.
Có hai loại gel thường dùng trong điện di là:
- Gel agarose: thích hợp trong phân tích các ADN sợi đơi, kích thước 300 –
10.000 cặp base. Ở các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Gel polyacrylamid: thích hợp để phân tách những đoạn ADN sợi đơn có kích thước dưới 500bp. Với gel polyacrylamid người ta có thể phân tách hai phân tử ADN chỉ sai khác nhau 1 nucleotide.
Sau khi phân tích bằng điện di, để phát hiện phân tử ADN, người ta dùng phương pháp hiện hình. Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide (C21H20BrN3). Ethidium bromide có khả năng gắn xen vào giữa các nucleotide của các phân tử ADN. Do đó các phân tử ADN sẽ gắn kết với ethidium bromide và phát huỳnh quang khi được kích thích bằng tia tử ngoại. Dựa vào vị trí các vệt huỳnh quang này người ta biết vị trí các đoạn ADN trên gel. Đối với gel polyacrylamid, các phân tử thường được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi hay bằng các đầu đọc tử ngoại chuyên biệt
Trong điện di, người ta thường dùng thang ADN chuẩn với mục đích so sánh và ước lượng kích thước của các phân tử điện di. Các thang chuẩn này là hỗn hợp nhiều đoạn ADN (đối với thang ADN) hay protein (đối với thang protein) đã biết kích thước. Dựa vào kích thước đã biết của các phân tử trên thang chuẩn và dựa vào sự so sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn để xác định kích thước các phân tử mục tiêu.
2.4.4.1. Chuẩn bị phản ứng Master Mix (15µl) Master Mix (15µl)
Bảng 2.2: Thành phần Master Mix cho một mẫu phản ứng PCR STT Thành phần Số lượng 1 dNTP 1µl 2 Buffer 2,5µl 3 Distiller Water 7,8µl 4 MgCl2 1,5µl 5 Primer sets 2µl
6 Taq – ADN polymerase 0.2µl
Sau đó thêm 10µl mẫu ADN, trộn đều. Công thức cặp mồi:
- P1: Forward 5’-TTT CCT GAT TTT TCT TAC TAT-3’
- P2: Reverse 5’-AAA TTA TAT AGC TAA ATA AC-3’
2.4.4.2. Thực hiện phản ứng
Thực hiện phản ứng trong máy luân nhiệt theo chương trình sau: Bước đầu làm biến tính ADN ở 940C trong 4 phút