Tiến hành:
Nguyên liệu: vảy mụn đậu của dê, hoặc cừu nghiền bằng chày cối sứ cùng dung dịch PBS tỉ lệ 1/10, để tách đồng hóa tế bào.
Ly tâm tách tế bào: ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút, trong 5 phút, lấy phần nước nổi, bỏ cặn, lọc qua màng lọc vơ trùng (0,45µl).
Phá vỡ tế bào: cho 20µl Qiagen protease vào đáy tube 1,5ml.
Thêm 200µl mẫu nốt mụn đậu đã chuẩn bị ở trên (hoặc mẫu máu) vào tube, trộn đều.
Cho 200µl dung dịch ALV vào tube 1,5ml (nếu để đơng thì phải làm cho tan giá hoàn toàn mới dùng).
Để ở nhiệt độ 560C trong 10 phút. Vảy mụn đậu Ly tâm tách tế bào Phá vỡ tế bào Loại bỏ protein tạp Thu ADN
Hòa vào dung dịch TE
Ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube.
Loại bỏ protein tạp: cho 200µl Ethanol 96% vào, vortex kỹ trong 15 phút, ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube.
Chuyển toàn bộ dung dịch trên sang cột lọc có tube chứa bên dưới. (chú ý: khơng để chạm, dính đầu pipet vào mép cột lọc).
Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút.
Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mớ i, vứt bỏ tube đựng có chứa n ước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW1vào cột lọc.
Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút.
Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứ a mới, vứt bỏ tube đựng có chứ a nước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW2 vào cột lọc.
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút.
Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứ a mới, vứt bỏ tube đựng có chứ a nước đã lọc. Thu AND: ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Chuyển cột lọc QIAam sang tube 1,5ml chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc.
Hòa vào dung dịch TE: cho 200µl dung dịch đệm TE vào cột lọc, để ở trong phòng 1 phút.
Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Giữ nguyên toàn bộ, vứt cột lọc QIAamp.
Bảo quản: đậy tube 1,5 ml, ghi số hiệu, bảo quản – 700C
2.4.4. Phương pháp PCR
Nguyên tắc của phản ứng
PCR là một phản ứng phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép ADN với sự tham gia của enzyme ADN – polymerase chịu nhiệt, có 2 đoạn ADN làm mồi và dùng các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi bổ sung với nó. Vì vậy, để khởi đầu quá trình tổng hợp ADN cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit. Đoạn này gắn với ADN khuôn tại điểm khởi đầu sao chép và được enzyme ADN – polymerase điều khiển tổng hợp một đoạn ADN đặc thù. Các sợi ADN mạch đơn làm khuôn được tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 900C ( 92 – 980C ) cho mạch xoắn kép bung ra.
Cả hai sợi ADN đều được dùng làm khn cho q trình tổng hợp nếu các đoạn mồi (Primer) được cung cấp để bám vào vị trí tương ứng cho cả hai sợi. Trong
cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu tại vị trí bám của mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài giới hạn giữa hai đoạn mồi này.
Độ dài sản phẩm của PCR có thể vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục ngàn cặp nucleotit. Như vậy sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại được nâng nhiệt thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới được tổng hợp, các sợi này sau đó cịn dùng tiếp cho chu kì tiếp theo bao gồm các bước gắn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn.
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lý thuyết ta sẽ có 2n bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi. Đó là một đặc điểm quan trọng của kỹ thuật PCR, dẫn đến kết quả là một đoạn ADN định trước được nhân lên với một số lượng lớn. Ví dụ sau 30 chu kỳ số lượng bản sao ADN của PCR sẽ là 1.073.741.824.
Các yếu tố cơ bản của phản ứng PCR [1],[2]
- Mồi: là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp chuyên biệt với đầu
5’ hay đầu 3’ của đoạn ADN cần khuếch đại. Mồi gồm có mồi xi và mồi ngược. Mồi xi là trình tự nucleotit bắt cặp với đầu 5’ của đoạn ADN cần khuếch đại. Tương tự, mồi ngược là mồi bắt cặp với đoạn 3’ của đoạn ADN khuôn mẫu.
- dNTPs (Deoxynucleotide triphosphat): là dung dịch gồm 4 thành phần deoxynucleotide (dATP, dTTP, dCTP, dGTP). Nồng độ sử dụng dung dịch dNTP sẽ tuỳ thuộc vào các điều kiện phản ứng chung.
- Enzyme ADN – polymerase: có vai trò kéo dài mạch mới bổ sung với mạch khuôn từ các mồi khởi đầu. Các enzyme ADN – polymerase hiện nay đều có tính chịu nhiệt, khơng bị huỷ ở nhiệt độ biến tính.
- Dung dịch đệm cho phản ứng PCR: bao gồm các thành phần sau: Tris HCl (pH 8.3), KCl, MgCl2 và gelatin. Thành phần và nồng độ dung dịch đệm sử dụng tuỳ thuộc vào loại ADN – polymerase sử dụng.
Dung dịch đệm có vai trị quan trọng trong việc tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP, kích hoạt vị trí hoạt động của enzyme ADN – polymerase. Dung dịch đệm có ảnh hưởng mạnh đến tính đặc hiệu và hiệu suất của phản ứng PCR.
Các bước tiến hành phản ứng PCR [11]
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ và mỗi chu kỳ gồm có ba bước:
Bước 1: Biến tính (Denaturation)
Được thực hiện ở nhiệt độ 90 – 980C trong 30 giây đến 1 phút thời gian lưu tương ứng khoản 30 giây đến 1 phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử ADN mạch kép bị tách ra (do liên kết hydro bị đứt), tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới.
Bước 2: Thực hiện phản ứng lai (Anealing)
Sau bước 1, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống và nhỏ hơn nhiệt độ Tm của mồi, vào khoảng 37 ÷ 680C và thời gian lưu là 30 giây đến một phút. Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với sợi khn. Mồi được tổng hợp hố học, có mồi ngược và xi. Người ta cịn có thể dựa vào trình tự nucleotide ở đầu 3’ của khuôn để tổng hợp mồi. Sau đó bổ sung ADN – polymerase để kéo dài mồi.
Bước 3: Tổng hợp mạch mới hay còn gọi là kéo dài (Extension).
Nâng nhiệt phản ứng lên 720C trong vài chục giây đến một phút để ADN – polymerase tổng hợp sợi mới. Trong thực tế, thời gian và nhiệt độ phản ứng phụ thuộc vào sợi ADN cần khuếch đại.
Kết thúc một chu kỳ từ một ADN kép mẹ tổng hợp hai sợi ADN kép con. Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25 đến 40 chu kỳ. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 720C trong khoảng 10 phút sao cho tất cả các sợi đơn xoắn lại và tạo nên sản phẩm của PCR. Sau đó hạ nhiệt độ 40C để bảo quản sản phẩm.