CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.6. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐẬU DÊ, CỪU
1.6.1. Chẩn đoán lâm sàng
Tại khu vực chăn nuôi dê, cừu chúng ta có thể nghi ngờ gia súc mắc bệnh đậu dê khi con vật có các biểu hiện như: sốt cao, chảy nhiều nước mắt, nước mũi, ủ rũ, kém ăn, lưng cong lên. Trên da nổi ban, bắt đầu với các vùng ban đỏ đặc biệt tại các phần cơ thể khơng có lơng, vùng da mỏng, niêm mạc, hình thành lên các nốt đậu,
sưng hạch lympho ở các vùng bị nhiễm: tăng sinh (có khi tới 8 lần kích thước bình thường) và tăng sinh tế bào lympho, tỷ lệ chết cao.
1.6.2. Bệnh tích mổ khám
Bệnh tích trên da: sung huyết, xuất huyết, phù nề, viêm mạch máu và hoại tử. Thường gặp hai dạng bệnh tích đậu trên da là dạng mụn nước và dạng nốt đậu. Với dạng mụn nước lúc đầu mụn đậu chuyển sang màu trắng nâu, khô dần, cứng lại thành vảy dễ bong ra. Với dạng nốt đậu, mụn đậu sưng to dần thành nốt sần ăn sâu vào da, tạo thành các nốt hoại tử và khi lành biến thành sẹo khơng có lơng.
Bệnh tích đậu trên niêm mạc mắt, miệng, mũi, hầu, nắp thanh quản, khí quản; trên niêm mạc dạ cỏ và dạ múi khế, trong âm hộ, bao quy đầu, nếp gấp âm vật, tinh hoàn, vú, núm vú.
Bệnh tích ở phổi: tổn thương đậu nghiêm trọng và lan rộng, phân bố tập trung và đồng dạng khắp lá phổi.
1.6.3. Chẩn đoán phân biệt
Cần chẩn đoán phân biệt bệnh đậu dê với các bệnh sau:
Bệnh viêm da có mủ truyền nhiễm (Contagious pustular dermatitis) – còn gọi là bệnh lở miệng (Scabby mouth)
Bệnh lưỡi xanh (Blue tongue)
Bệnh viêm da do nấm (Mycotic dermatitis)
Bệnh nấm vảy của Cừu (Sheep scab)
Bệnh ghẻ (Manges) và dị ứng ngoài da do nắng (Photosensitisation)
Côn trùng đốt (Insect bites)
Viêm phổi do ký sinh trùng (Parasitic pneumonia)
Ecthyma truyền nhiễm (Contagious ecthyma)
Dịch tả (Peste des petits ruminants)
Trong một số trường hợp, gia súc không biểu hiện triệu chứng lâm sàng, cần lấy bệnh phẩm của các con vật bị bệnh để xét nghiệm trong phịng thí nghiệm.
1.6.3. Chẩn đốn thí nghiệm
Có nhiều phản ứng dùng chẩn đốn thí nghiệm bệnh đậu dê. Mới đầu, việc xét nghiệm bệnh đậu dê chủ yếu giới hạn bằng phản ứng AGID. Sau đó, một kháng nguyên tiểu phần hịa tan, khơng có khả năng gây nhiễm, đã thay thế một cách hiệu
quả virus gây nhiễm trong hàng loạt các phản ứng huyết thanh học. Việc sử dụng chúng có thể tránh được nguy cơ lan truyền của virus từ phịng thí nghiệm; nó bảo đảm an tồn trong việc vận chuyển và cung cấp hóa chất thí nghiệm tới nhiều địa chỉ. Hàng loạt phản ứng chẩn đoán bệnh đậu dê được thực hiện gần đây đã sử dụng kháng nguyên tiểu phần và kháng huyết thanh của nó [30],[34]. Việc phát hiện ra virus đậu dê hoặc các kháng nguyên của nó có thể được thực hiện bằng phân lập virus và phản ứng trung hịa trong ni cấy tế bào (nuôi cấy tế bào tinh hoàn, thận cừu non) kháng thể huỳnh quang hoặc quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Tuy nhiên, việc chẩn đoán bệnh đậu dê bằng các kỹ thuật virus học hoặc huyết thanh học cổ điển phụ thuộc những con vật còn sống là khơng thích hợp với các quốc gia tại đó virus độc lực cao hoặc khơng có sẵn virus sống. Vì vậy, các phương pháp chẩn đoán dựa trên những công cụ sinh học phân tử mới nhất như phản ứng PCR là rất hiệu quả để phát hiện nucleic acid của virus đậu dê ở nhhững nước đó.
Các bệnh phẩm dùng để chẩn đoán
Để chẩn đoán huyết thanh học, cần lấy mẫu máu kép từ con vật có biểu hiện
sốt cao. Để chẩn đoán và giám định virus, bệnh phẩm có thể là mẫu máu, dịch mụn đậu, vảy mụn đậu, vết xước của tổn thương ngoài da và các tổn thương ở đường hô hấp và đường tiêu hoá. Nên lấy mẫu trong tuần đầu tiên khi triệu chứng lâm sàng xuất hiện và bảo quản bệnh phẩm trong nhiệt độ âm.
Phân lập virus
Capripoxvirus nói chung và virus gây bệnh đậu dê, cừu nói riêng thích nghi với các môi trường là mơ tổ chức có nguồn gốc từ bò, dê, cừu, đặc biệt là các môi trường thận cừu, dịch hoàn cừu sơ cấp hoặc thứ cấp. Tuy nhiên, virus đậu dê gây bệnh tích tế bào sớm nhất là 4 ngày sau gây nhiễm, do đó cần kiểm tra các môi trường tế bào đã nhiễm bệnh phẩm trong vòng 14 ngày. Một số chủng
Capripoxvirus có thể thích nghi với tế bào thận khỉ xanh Châu Phi (tế bào Vero).
Cấy vào phôi thai gà
Tiêm huyễn dịch mụn đậu vào màng nhung niệu của phôi thai gà 11 - 13 ngày, sau 3 - 4 ngày hoặc 6 - 7 ngày sẽ xuất hiện mụn đậu trên màng thai và gây bệnh tích màng thai như màng dày, phù nề giống chất gelatin.
Nuôi trên môi trường tế bào thận cừu non và tinh hoàn cừu
Cấy vào môi trường tế bào thận cừu non hoặc tinh hoàn cừu một lớp sau 24 – 72 h, tế bào bị thối hóa, biến dạng và tan vỡ màng tế bào.
Quan sát tiểu thể bao hàm chứa hạt virus dưới kính hiển vi
Chọn mụn đậu chưa vỡ, rửa 2-3 lần bằng nước cất rồi lấy mụn đậu hay mủ trong mụn đậu phết lên kính làm tiêu bản nhuộm Giemsa hay Mơrơsơp rồi xem kính, quan sát thấy tiểu thể bao hàm trong nguyên sinh chất.
Phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp
Tiêu bản kiểm tra được chuẩn bị từ nốt đậu trên da, phổi được cắt lạnh trên lam
kính trong mơi trường tế bào đã được gây nhiễm với bệnh phẩm. Cố định tiêu bản bằng aceton, sau đó ủ với chất cộng hợp (conjugat chế từ huyết thanh thỏ tối miễn dịch kháng Capripoxvirus đã tinh khiết). Rửa tiêu bản, hong khơ rồi kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang và đánh giá kết quả.
Phương pháp miễn dịch khuếch tán trên thạch (Agar Gel Imunodiffusion
Test – AGID)
Việc sử dụng kỹ thuật khuếch tán trong thạch để chẩn đoán bệnh đậu dê đã được ứng dụng từ những năm đầu của thập kỷ 1960 [13]. Sau đó, việc sử dụng kháng nguyên đánh dấu bằng Methionine [35S] đã cải thiện đáng kể độ nhạy của phản ứng AGID dùng phát hiện kháng thể của Capripoxvirus [20]. AGID rất đơn giản và có thể áp dụng thực hiện ở bất cứ nơi nào đặc biệt ở những khu vực xa xơi hẻo lấnh vì chỉ yêu cầu các trang thiết bị thí nghiệm tối thiểu là có thể thực hiện được [30].
Pha thạch agarose 1% trong dung dịch đệm borat có pH = 8,6. Hấp vô trùng, đổ
thạch ra đĩa phản ứng, đục thành cụm gồm 1 giếng ở giữa và 6 giếng xung quanh, đường kính từng giếng là 5mm, khoảng cách tâm điểm của giếng ở giữa và các giếng xung quanh là 7mm. Nhỏ 18l huyết thanh đối chứng Capripoxvirus dương tính vào giếng ở giữa, nhỏ vào các giếng xung quanh các mẫu huyễn dịch bệnh phẩm cần xét nghiệm. Dành 2 giếng cho các mẫu kháng nguyên đối chứng dương và âm với thể tích 18l/giếng. Ủ trong hộp ấm ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. Kiểm tra vạch kết tủa của giếng giữa và các giếng xung quanh.
ELISA - Kỹ thuật chất hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (Enzyme – link immunosorbent assays)
Đây là kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên (KN) hoặc kháng thể (KT) ở nồng độ thấp (khoảng 0,1ng/ml). Hai kỹ thuật ELISA được dùng nhiều là kỹ thuật trực tiếp và kỹ thuật gián tiếp (hay kỹ thuật “sanwich” – bánh kẹp).
Kỹ thuật bánh kẹp: nhỏ kháng huyết thanh chứa KT vào giếng ở bản nhựa để cho KT bám vào thành giếng, nhỏ tiếp dịch KN cần xét nghiệm. Nếu là KN đặc hiệu với KT thì sẽ gắn với KT, thêm cộng hợp KT gắn enzyme vào giếng để cho KT cộng hợp gắn với KN mà trước đó đã gắn với KT đầu tiên, tạo nên một “bánh kẹp” KT – KN – KT gắn enzyme, cuối cùng bổ sung cơ chất của enzyme. Enzyme thuỷ phân cơ chất làm thay đổi màu dung dịch. Tốc độ thuỷ phân của enzyme tỷ lệ thuận với lượng KT gắn enzyme, cũng có nghĩa tỷ lệ thuận với KN cần xét nghiệm.
Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gián tiếp: nhỏ dịch KN cho hấp phụ lên thành giếng, nhỏ tiếp kháng huyết thanh (chứa kháng thể) cần xét nghiệm rồi ủ. Nếu trong huyết thanh có chứa KT đặc hiệu với KN thì sẽ gắn với nó, thêm cộng hợp kháng – KT đã gắn enzyme, thêm cơ chất của enzyme. Tốc độ thuỷ phân của cơ chất gắn liền với sự thay đổi màu dung dịch và tỷ lệ thuận với lượng KT cần xác định trong mẫu.
Kỹ thuật PCR
Phương pháp PCR - phản ứng dây truyền nhờ hoạt động của enzyme ADN – polymerase – do Kary Mullis cùng cộng sự phát minh năm 1985, đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học sinh học phân tử. Đây là phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu, phân tích gen và hệ gen. Khó khăn lớn nhất trong việc phân tích gen ở chỗ chúng là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp khổng lồ. Kỹ thuật PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn ADN mong muốn.
Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR được nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký sinh trùng và cho kết quả rất chính xác. Mặt khác sự phân tích thành phần
phân loại các lồi sinh vật. Chính nhờ tính thực tiễn to lớn của kỹ thuật này tác giả của PCR, Kary Mulis, được tặng giải thưởng Nobel vào năm 1993.
Kỹ thuật PCR có độ nhạy cao, cho phép xác định chính xác Capripoxviruses
trong các mẫu sinh thiết da và nuôi cấy tế bào trong khi các phương pháp trên có thể xảy ra phản ứng chéo với một số virus khác.
Ưu điểm của phương pháp PCR [2]
Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình tự đáng quan tâm.
Thực hiện đơn giản và ít tốn kém (nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiện đồng thời), yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu không cao (vết máu khơ, mẫu vật khảo cổ, những vết tích để lại của người đã chết).
Nhược điểm của phương pháp PCR [2]
Cần phải có ADN mồi đặc trưng cho ADN cần khuếch đại. Để có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuyếch đại.
Kích thước ADN cần khuếch đại khơng vượt quá 3 kb. Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần).
Sai sót cịn do sử dụng enzyme Taq- polymerase khoảng 104 (sai sót cho một lần sao chép).