Phương pháp xử lý mẫu

Mẫu máu, vảy mụn đậu của dê, cừu ốm chết nghi mắc bệnh đậu dê, đậu cừu đã thu thập.

Tách ADN

Chiết tách ADN bằng kit QIAamp ADN MiniKIT (hãng sản xuất Qiagen – Cat No: 51106).

Dụng cụ: - Micropipet các loại 100, 200, 1000µl

- Đầu típ các loại tương ứng

- Tube 1,5 ml (không có men ARNase, ADNse)

Hình 2.1. Quy trình tách chiết ADN từ vảy mụn đậu

Tiến hành:

 Nguyên liệu: vảy mụn đậu của dê, hoặc cừu nghiền bằng chày cối sứ cùng dung dịch PBS tỉ lệ 1/10, để tách đồng hóa tế bào.

 Ly tâm tách tế bào: ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút, trong 5 phút, lấy phần nước nổi, bỏ cặn, lọc qua màng lọc vô trùng (0,45µl).

Phá vỡ tế bào: cho 20µl Qiagen protease vào đáy tube 1,5ml.

Thêm 200µl mẫu nốt mụn đậu đã chuẩn bị ở trên (hoặc mẫu máu) vào tube, trộn đều.

Cho 200µl dung dịch ALV vào tube 1,5ml (nếu để đông thì phải làm cho tan giá hoàn toàn mới dùng).

Để ở nhiệt độ 56⁰C trong 10 phút. Vảy mụn đậu Ly tâm tách tế bào Phá vỡ tế bào Loại bỏ protein tạp Thu ADN

Hòa vào dung dịch TE

Ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube.

 Loại bỏ protein tạp: cho 200µl Ethanol 96% vào, vortex kỹ trong 15 phút,

ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube.

Chuyển toàn bộ dung dịch trên sang cột lọc có tube chứa bên dưới. (chú ý: không để chạm, dính đầu pipet vào mép cột lọc).

Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút.

Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mớ i, vứt bỏ tube đựng có chứa n ước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW1vào cột lọc.

Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút.

Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứ a mới, vứt bỏ tube đựng có chứ a nước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW2 vào cột lọc.

Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút.

Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứ a mới, vứt bỏ tube đựng có chứ a nước đã lọc. Thu AND: ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.

Chuyển cột lọc QIAam sang tube 1,5ml chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc.

 Hòa vào dung dịch TE: cho 200µl dung dịch đệm TE vào cột lọc, để ở trong

phòng 1 phút.

Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Giữ nguyên toàn bộ, vứt cột lọc QIAamp.

 Bảo quản: đậy tube 1,5 ml, ghi số hiệu, bảo quản – 70⁰C