Đọc kết quả sản phẩm PCR [9],[11]
Sản phẩm của PCR được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose để phát hiện đa hình của các đoạn ADN đặc thù, hoặc các đoạn ADN bị thay đổi do các tác nhân nào đó (đột biến, tái tổ hợp). Nồng độ phần trăm agarose trong gel phụ thuộc vào kích thước phân đoạn ADN, thông thường người ta hay sử dụng gel agarose 0,7%. Trong trường hợp kích thước phân đoạn ADN nhỏ hơn 1kb người ta hay đổ gel 1, 1,5 hoặc 2%, tùy theo kích thước của nó nhỏ mức nào.
Nguyên tắc của kỹ thuật điện di [9],[11]
Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử người ta thường sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử ADN nguyên vẹn, ADN bị cắt hạn chế và ADN của sản phẩm PCR.
Trong một điện trường, các phân tử tích điện thuộc pha lỏng sẽ di chuyển về các cực. Vận tốc di chuyển của các phân tử tuỳ thuộc vào tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng của chính các phân tử này. Như vậy giữa các phân tử có cùng khối lượng, phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về cực ngược dấu nhanh hơn.
ADN là một phân tử tích điện âm vì vậy chúng có thể dịch chuyển qua bảng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) dưới tác dụng của điện trường. Trên cùng một bản gel có cùng một dịng điện những phân tử ADN khác nhau về
nhau sau một thời gian như nhau. Kích thước phân tử càng lớn thì sự di chuyển trên trên gel càng chậm. Vì vậy tuỳ theo kích thước phân tử và tuỳ theo mức độ cần phân tách mà người ta chọn loại gel và nồng độ gel thích hợp để dùng trong điện di.
Có hai loại gel thường dùng trong điện di là:
- Gel agarose: thích hợp trong phân tích các ADN sợi đơi, kích thước 300 –
10.000 cặp base. Ở các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau.
- Gel polyacrylamid: thích hợp để phân tách những đoạn ADN sợi đơn có kích thước dưới 500bp. Với gel polyacrylamid người ta có thể phân tách hai phân tử ADN chỉ sai khác nhau 1 nucleotide.
Sau khi phân tích bằng điện di, để phát hiện phân tử ADN, người ta dùng phương pháp hiện hình. Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide (C21H20BrN3). Ethidium bromide có khả năng gắn xen vào giữa các nucleotide của các phân tử ADN. Do đó các phân tử ADN sẽ gắn kết với ethidium bromide và phát huỳnh quang khi được kích thích bằng tia tử ngoại. Dựa vào vị trí các vệt huỳnh quang này người ta biết vị trí các đoạn ADN trên gel. Đối với gel polyacrylamid, các phân tử thường được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi hay bằng các đầu đọc tử ngoại chuyên biệt
Trong điện di, người ta thường dùng thang ADN chuẩn với mục đích so sánh và ước lượng kích thước của các phân tử điện di. Các thang chuẩn này là hỗn hợp nhiều đoạn ADN (đối với thang ADN) hay protein (đối với thang protein) đã biết kích thước. Dựa vào kích thước đã biết của các phân tử trên thang chuẩn và dựa vào sự so sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn để xác định kích thước các phân tử mục tiêu.
2.4.4.1. Chuẩn bị phản ứng Master Mix (15µl) Master Mix (15µl)
Bảng 2.2: Thành phần Master Mix cho một mẫu phản ứng PCR STT Thành phần Số lượng 1 dNTP 1µl 2 Buffer 2,5µl 3 Distiller Water 7,8µl 4 MgCl2 1,5µl 5 Primer sets 2µl
6 Taq – ADN polymerase 0.2µl
Sau đó thêm 10µl mẫu ADN, trộn đều. Công thức cặp mồi:
- P1: Forward 5’-TTT CCT GAT TTT TCT TAC TAT-3’
- P2: Reverse 5’-AAA TTA TAT AGC TAA ATA AC-3’
2.4.4.2. Thực hiện phản ứng
Thực hiện phản ứng trong máy luân nhiệt theo chương trình sau: Bước đầu làm biến tính ADN ở 940C trong 4 phút
Tiếp theo 35 chu kỳ: 470C trong 1 phút 720C trong 1 phút 950C trong 45 giây Cuối cùng 720C trong 10 phút.
2.4.4.3. Chạy điện di
Chạy điện di sản phẩm PCR trên bộ điện di nằm ngang (Apelex, model MiniGel XL)
Chuẩn bị gel điện di agarose(1,5%): cân 1,05g agarose cho vào 100ml dung
dịch TBE 1X đun trong lị vi sóng để hịa tan agarose, để nguội xuống 50 - 600C cho thêm 6µl Ethidium bromide lắc đều, đổ ra khuôn đã chuẩn bị sẵn, cắm lược vào. Để agarose đông lại ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Khi gel đã đông cứng, rút lược, cho khuôn vào khay điện di, đổ đệm TBE 1X ngập mặt thạch.
Nạp mẫu ADN: dùng micropipet hút 10µl sản phẩm PCR vào theo thứ tự giếng.
Chạy điện di: sau khi nạp mẫu xong, nối dòng điện dẫn vào buồng điện di với nguồn điện 110 volt dòng điện 1 chiều, chạy trong 30 phút.
2.4.4.4. Đọc kết quả
Sau khi lấy ra khỏi buồng điện di, chuyển gel lên bộ đọc điện di (Model Bioprint, Vilber Lourmat, France) có gắn hệ thống chụp ảnh điện di (model Bio- print 1000/20) nối với máy tính. Sản phẩm PCR có độ dài 192bp là các mẫu dương tính.
2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học kết hợp với phần mềm Excel. 2.6. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Địa điểm: bộ môn nghiên cứu Siêu Vi trùng - Phân Viện Thú Y Miền Trung -
Nha Trang, Khánh Hoà.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH ĐẬU DÊ, CỪU BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRA DỊCH TỄ
3.1.1. Kết quả điều tra tình hình bệnh đậu trên dê, cừu theo tổng đàn điều tra Chúng tôi đã tiến hành điều tra tình hình dê, cừu mắc bệnh đậu tại các địa phương nghiên cứu, dựa vào phiếu điều tra kết hợp phỏng vấn thú y cơ sở và người chăn nuôi, khảo sát trực tiếp tại các hộ chăn ni thuộc các tỉnh Khánh Hồ, Ninh Thuận, Đắc Lắc. Những dê, cừu có các TCLS sau đây:
- Mệt mỏi, ủ rũ, chảy nước mắt mũi, nước bọt
- Bỏ ăn, lưng cong lên
- Sốt cao 40 – 410C
- Xuất hiện các nốt ban đỏ trên da
- Các nốt ban chuyển thành mụn nước, sau đó hình thành nên vảy đậu
- Nốt đậu mọc ở da mặt, môi và ở các vùng da mỏng (bẹn, âm hộ, lách,…)
- Hạch lympho sưng (trước vai, dưới hàm…)
- Sảy thai
- Sưng bầu vú
Bệnh tích: - Da sung huyết, xuất huyết, phù nề
- Hạch lympho tăng sinh
- Nốt đậu mọc mắt, mũi, miệng…
- Nốt đậu ở thanh, khí quản, phổi
- Nốt đậu ở âm hộ, vú, núm vú
- Nốt đậu ở bao quy đầu, tinh hoàn
- Lợi và lưỡi có nhiều nốt loét được nghi mắc bệnh đậu.
Qua quá trình tiến hành điều tra số liệu dê, cừu ở 2 khu vực chăn nuôi (trang trại và hộ gia đình) tại các địa phương nghiên cứu thuộc 3 tỉnh Khánh Hòa, Ninh Thuận, Đắc Lắc nghi mắc bệnh đậu trong thời gian 2 năm (từ năm 2007 đến tháng
Kết quả được trình bày ở bảng 3.1:
Bảng 3.1: Kết quả điều tra tỷ lệ dê, cừu mắc bệnh đậu theo tổng đàn điều tra
Ghi chú: - GĐ: gia đình - SL: số lượng
Kết quả cho thấy, trong năm 2007, số con nghi mắc bệnh là 5.111 con trong tổng số 26.310 con dê, cừu điều tra chiếm tỷ lệ 19,43%. Nhìn chung, tỷ lệ mắc bệnh ở khu vực chăn nuôi trang trại cao hơn khu vực chăn ni hộ gia đình, cao nhất ở Khánh Hòa (30,00%), tiếp đó là ở Ninh Thuận (20,99%) và thấp nhất ở Đắc Lắc (12,99%). Kết quả điều tra cũng cho thấy tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh đậu ở Khánh Hòa là cao nhất (27,36%), tiếp đến là ở Ninh Thuận (19,49%), thấp nhất ở Đắc Lắc (12,48%). Trong năm 2007, dịch bệnh đậu dê bùng phát ở rất nhiều địa phương trong khu vực miền Trung gây tỷ lệ chết cao ở dê có nơi đến 80%. Kết quả điều tra ở các địa phương nghiên cứu cũng phản ánh tình hình dịch bệnh đậu bùng phát. Từ tháng 1 – 10/2008, bệnh đậu dê có chiều hướng giảm. Kết quả điều tra đến tháng 10/2008 có 1.273 dê, cừu nghi mắc bệnh đậu trong tổng số 18.310 con điều tra, chiếm 6,95%. Qua bảng số liệu cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh ở 2 khu vực chăn ni trang trại và chăn ni hộ gia đình tại các địa phương nghiên cứu không chênh lệch nhau nhiều. Tỉnh Ninh Thuận có tỷ lệ dê, cừu mắc bệnh cao nhất (7,64%), Đắc Lắc
2007 Đến 10/2008 Địa phương Khu vực SL dê, cừu (con) SL nghi mắc bệnh (con) Tỷ lệ (%) SL dê, cừu (con) SL nghi mắc bệnh (con) Tỷ lệ (%) Trang trại 2.970 891 30,00 1.730 98 5,66 Khánh Hòa Hộ GĐ 1.246 308 24,72 987 49 4,96 Trang trại 9.350 1.963 20,99 5.471 410 7,49 Ninh Thuận Hộ GĐ 6.430 1.157 17,99 4.325 337 7,79 Trang trại 3.573 464 12,99 3.450 220 6,38 Đắc Lắc Hộ GĐ 2.741 328 11,97 2.347 159 6,77 Cộng 26.310 5.111 19,43 18.310 1.273 6,95
bùng phát năm 2006 - 2007 làm dê chết hàng loạt gây thiệt hại lớn về kinh tế, do vậy người chăn ni dê, cừu đã có ý thức chủ động phòng bệnh bằng vắc xin và áp dụng các biện pháp vệ sinh phòng bệnh.
3.1.2. Kết quả điều tra tỷ lệ dê, cừu mắc bệnh đậu theo mùa vụ (tháng 1-10/2008) 10/2008)
Mùa vụ liên quan chặt chẽ tới nhiệt độ, độ ẩm môi trường, bên cạnh đó là những điều kiện về ngoại cảnh khác nhau cho sự xuất hiện và phát triển của mầm bệnh. Mặt khác, sự thay đổi của mùa có những tác động và ảnh hưởng lớn tới sức đề kháng của cơ thể động vật… Chúng tôi cũng tiến hành điều tra tỷ lệ dê, cừu mắc bệnh đậu theo 2 mùa: mùa khô (từ tháng 1 – 8/2008) và mùa mưa (từ tháng 9 – 10/2008). Tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh ở từng địa phương theo từng mùa được thể hiện ở hình 3.1 và bảng 3.2 (xem phụ lục 3): 4,86,21 5,49 4,49 12,97 10,34 0 2 4 6 8 10 12 14
Khánh Hòa Ninh Thuận Đắc Lắc
Địa phương
Tỷ lệ (%)
Mùa khô Mùa mưa
Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn kết quả điều tra tỷ lệ dê, cừu mắc bệnh đậu theo mùa Từ hình 3.1 cho thấy: ở mùa khô, tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh đậu cao nhất ở Ninh Thuận với tỷ lệ (5,49%), tiếp đến là ở Khánh Hòa (4,80%) và thấp nhất ở Đắc Lắc (4,49%).
Mùa mưa, nổi bật cao nhất ở Ninh Thuận với tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh đậu là (12,97%), thấp nhất là ở Khánh Hòa (6,21%), còn ở Đắc Lắc (10,34%). Như vậy, tỷ lệ mắc bệnh ở mùa mưa (chỉ điều tra trong 2 tháng đầu mùa mưa là tháng 9 và tháng 10) cao hơn rất nhiều so với mùa khô nhất là ở 2 tỉnh Ninh
Thuận và Đắc Lắc. Điều này phù hợp với đặc tính của dê, cừu ưa khí hậu khơ khơng chịu được khí hậu ẩm ướt. Vào mùa mưa, lượng mưa nhiều làm độ ẩm không khí tăng cao, nhiệt độ giảm, đặc biệt ở Ninh Thuận và Đắc Lắc vào mùa mưa thời tiết khắc nhiệt hơn mưa nhiều, khu vực chăn nuôi luôn ẩm ướt. Bên cạnh đó với phương thức chăn ni bán chăn thả khâu vệ sinh phịng bệnh khơng đảm bảo dẫn đến dê, cừu dễ mắc bệnh. Trong chăn nuôi dê, cừu cũng như chăn ni gia súc nói chung, ngồi việc cung cấp đủ thức ăn thì việc phịng chống các bệnh, kết hợp với giữ ấm và vệ sinh sạch sẽ cho gia súc đóng vai trò đặc biệt quan trọng nhằm giảm thấp nhất nguy cơ nhiễm bệnh, thiệt hại do tác động của thời tiết gây ra.
3.1.3. Kết quả điều tra tỷ lệ dê, cừu mắc bệnh đậu theo độ tuổi
Trên cơ sở số liệu điều tra từ tháng 1 đến tháng 10/2008, chúng tơi tiến hành phân tích tổng hợp số liệu dê, cừu mắc bệnh chia theo 3 độ tuổi: từ sơ sinh đến < 3 tháng tuổi, từ 3 – 6 tháng tuổi, > 6 tháng tuổi. Kết quả được thể hiện qua bảng 3.3: Bảng 3.3: Kết quả điều tra tỷ lệ dê, cừu mắc bệnh đậu dê theo độ tuổi
Độ tuổi mắc bệnh Sơ sinh đến < 3 tháng Từ 3 - 6 tháng > 6 tháng Địa phương Số ĐT (con) Số MB (con) Tỷ lệ (%) Số ĐT (con) Số MB (con) Tỷ lệ (%) Số ĐT (con) Số MB (con) Tỷ lệ (%) Khánh Hoà 735 43 5,85 962 58 6,03 1.020 46 4,51 Ninh Thuận 2.473 187 7,56 3.565 305 8,56 3.758 255 6,79 Đắc Lắc 1.672 123 7,36 2.016 157 7,79 2.109 99 4,69 Từ bảng 3.3 cho thấy:
Ở lứa tuổi từ sơ sinh đến < 3 tháng, Ninh Thuận có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất có 187 con mắc bệnh trong 2.473 con điều tra chiếm tỷ lệ (7,56%), tiếp đó là Đắc
Lắc có 123 con mắc bệnh trong 1.672 con điều tra chiếm tỷ lệ (7,36%), và thấp nhất là Khánh Hồ có 43 con mắc bệnh trong 735 con điều tra chiếm (6,03%).
Ở độ tuổi từ 3 – 6 tháng tuổi, tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở Ninh Thuận (8,56%), tiếp đó là Đắc Lắc (7,49%), thấp nhất ở Khánh Hoà (6,03%)
Ở độ tuổi > 6 tháng tuổi, cũng như ở trên Ninh Thuận có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất trong 3.758 con dê, cừu điều tra có 255 con mắc bệnh, chiếm (6,79%), tỉnh Đắc Lắc điều tra 2.109 con có 99 con mắc bệnh chiếm (4,69%), và thấp nhất là Khánh Hoà điều tra 1.020 dê, cừu có 46 con mắc bệnh chiếm (4,51%).
Qua bảng số liệu cũng cho thấy, ở lứa tuổi dê, cừu từ 3 – 6 tháng tuổi tại cả 3 tỉnh Khánh Hoà, Ninh Thuận, Đắc Lắc đều có tỷ lệ dê, cừu mắc bệnh cao nhất, tiếp đến là ở độ tuổi sơ sinh đến <3 tháng tuổi, và thấp nhất ở độ tuổi > 6 tháng tuổi. Thực tế trong từng giai đoạn phát triển của dê, cừu con từ sơ sinh đến trưởng thành liên quan chặt chẽ tới sự hoàn thiện các cơ quan trong hệ thống cơ thể, nhất là hệ thần kinh, hệ tiêu hóa và đặc biệt là hệ thống đáp ứng miễn dịch của cơ thể, từ đó ảnh hưởng tới khả năng mắc bệnh của dê, cừu. Bên cạnh đó, ở độ tuổi > 6 tháng phần lớn đã được tiêm phịng vaccine hoặc sống sót sau vụ dịch nên bản thân đã có kháng thể chống lại bệnh, còn sơ sinh đến < 3 tháng tuổi cũng có thể nhận khả năng miễn dịch của mẹ truyền sang.
3.1.4. Kết quả điều tra tỷ lệ mắc bệnh đậu theo phương thức chăn nuôi
Qua điều tra tại 3 tỉnh Khánh Hòa, Ninh Thuận, Đắc Lắc chúng tôi nhận thấy các hộ chăn nuôi dê, cừu chủ yếu sử dụng 2 phương thức chăn nuôi là chăn nuôi bán chăn thả và ni nhốt.
6,14 7,88 7,14 3,23 6,79 4,24 0 2 4 6 8 10
Khánh Hịa Ninh Thuận Đắc Lắc
Địa phương
Tỷ lệ
(%) Bán chăn thả
Ni nhốt
Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn kết quả điều tra tỷ lệ dê, cừu mắc bệnh đậu theo phương thức chăn nuôi
Tại cả 3 tỉnh điều tra, ở phương thức chăn ni bán chăn thả có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn phương thức chăn nuôi nhốt. Có thể do phương thức chăn nuôi bán chăn thả, con vật dễ tiếp xúc với mầm bệnh, yếu tố vệ sinh không được đảm bảo đặc biệt vào mùa mưa. Trong khi đó, phương thức chăn nuôi nhốt, người chăn ni chủ động tìm kiếm cung cấp thức ăn cho con vật và khâu vệ sinh chuồng trại tốt hơn. Ở phương thức chăn nuôi bán chăn thả, Ninh thuận có tỷ lệ nhiễm bệnh đậu cao nhất (7,88%), tiếp đó ở Đắc Lắc (7,14%), và thấp nhất ở Khánh Hòa (6,14%).
Ở phương thức chăn nuôi nhốt, tỷ lệ nhiễm bệnh đậu cao nhất cũng là Ninh Thuận (6,79%), Đắc Lắc (4,24%), Khánh Hòa thấp nhất (3,23%).
Kết quả điều tra của chúng tơi mang tính chất tương đối, chủ yếu dựa vào TCLS của dê, cừu mắc bệnh, kết hợp với phỏng vấn thú y cơ sở và người chăn ni. Vì vậy, có thể nhầm lẫn với một số bệnh khác như:
Bệnh viêm da có mủ truyền nhiễm (Contagious pustular dermatitis) – còn gọi là bệnh lở miệng (Scabby mouth)
Bệnh lưỡi xanh (Blue tongue)
Bệnh viêm da do nấm (Mycotic dermatitis)
Bệnh nấm vảy của cừu (Sheep scab)