Đặc điểm của tế bào vi khuẩn
- Hình dạng tế bào vi khuẩn: Đa số có dạng que ngắn 23/25 dòng chiếm 92,0%, ngồi ra cịn có dạng que dài 02/25 dịng chiếm 8,0%.
- Khả năng chuyển động: Hầu hết các dòng chuyển động được 23/25 dòng chiếm 92,0%, khơng chuyển động là 02/25 dịng chiếm 8,0%.
Chụp dưới kính hiển vi điện tử quét JSM 5500 cho thấy dịng 01.L.1 có dạng hình que dài (hình 19).
Hình 19. Hình dạng dịng vi khuẩn 05.L.4 chụp dưới kính hiển vi điện tử ở độ phóng
đại 12000 lần (ngày 15/05/2012) 1.L.1 9.L.1 12.L.2 5.L.4 13.L.3 13.L.2
4.3. Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P
4.3.1. Kết quả tuyển chọn vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
Kết quả kiểm tra khả năng kết tụ của các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học được trình bày ở bảng 19 (phụ lục 3).
Tỉ lệ kết tụ của 28 dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học như sau: có 01 dịng có tỉ lệ kết tụ trên 50% chiếm 3,57%; 02 dịng có tỉ lệ kết tụ từ 40 đến 50% chiếm 7,14%; 08 dịng có tỉ lệ kết tụ từ 30 đến 40% chiếm 28,57%; 08 dịng có tỉ lệ kết tụ từ 20 đến 30% chiếm 28,57%; 09 dịng có tỉ lệ kết tụ từ 10 đến 20% chiếm 32,14%.
Chọn 02 dịng có tỉ lệ kết tụ cao nhất là 03.PS.3 (tỉ lệ kết tụ là 44,09%) và 04.P.1 (tỉ lệ kết tụ là 50,87%) để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
4.3.2. Kết quả tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Kết quả khảo sát khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ trên mơi trường minimal có bổ sung NH4+
, NO3-, NO2- qua các nồng độ tăng dần trình bày ở bảng 20 (phụ lục 3). Kết quả cho thấy, đa số các dịng phát triển trên mơi trường này, chứng tỏ các dịng có khả năng chuyển hóa nitơ, tuy nhiên khả năng chuyển hóa của các dòng giảm khi nồng độ tăng dần. Cụ thể như sau:
Vi khuẩn oxy hóa ammonium
Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn oxy hóa ammonium trên mơi trường minimal bổ sung NH4+ trình bày ở hình 20.
33 33 31 29 26 17 15 12 0 0 10 20 30 40 100 200 300 400 500 600 700 800 900 nồng độ ammonium (mM) số dị ng ph át tr iể n
Hình 20. Số dịng vi khuẩn oxy hóa ammonium phát triển trên mơi trường minimal bổ sung NH4+
Ở nồng độ 100 – 400 mM thì đa số các dòng đều phát triển, chỉ một vài dịng khơng phát triển. Chứng tỏ các dịng này có khả năng oxy hóa ammonium ở nồng độ
từ 100 – 400mM. Các dòng phát triển tiếp tục được khảo sát ở nồng độ từ 500 - 900 mM, kết quả khả năng phát triển của các dòng này vẫn mạnh nhưng giảm dần khi nồng độ NH4+
tăng dần.
Ở nồng độ 800mM, khả năng phát triển của các dịng vi khuẩn giảm rõ rệt. Có 12 dịng chiếm 36,36% phát triển, trong đó có 03 dịng chiếm 9,09% phát triển mạnh (12.H4.1, 12.H4.2, 14.H4.4).
Ở nồng độ 900 mM, hầu hết 33/33 dịng đều khơng phát triển, cho thấy các dịng vi khuẩn khơng có khả năng oxy hóa ammonium ở nồng độ này.
Vi khuẩn khử nitrate
Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn khử nitrate trên môi trường minimal bổ sung NO3-
trình bày ở hình 21.
Ở nồng độ 100 – 500 mM, đa số các dòng đều phát triển, chỉ một vài dịng khơng phát triển, điều này cho thấy các dịng có khả năng khử nitrate ở nồng độ này.
31 31 31 30 29 26 20 18 9 0 0 10 20 30 40 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 nồng độ nitrate (mM) số dị ng ph át tr iể n
Hình 21. Số dịng vi khuẩn khử nitrate phát triển trên môi trường minimal bổ sung
NO3-
Các dòng phát triển được khảo sát tiếp ở nồng độ từ 600 – 1000 mM. Kết quả cho thấy khả năng phát triển của các dòng này vẫn mạnh nhưng giảm dần khi nồng độ NO3- tăng dần.
Ở nồng độ 900 mM thì khả năng phát triển của các dịng vi khuẩn giảm rõ rệt. Có 9 dòng chiếm 29,03% phát triển, trong đó có 04 dịng chiếm 12,9% phát triển mạnh (03.O3.2, 06.O3.1, 12.O3.3, 14.O3.1).
Ở nồng độ 1000mM, cả 31 dịng đều khơng phát triển khơng có khả năng khử
Vi khuẩn khử nitrite
Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn khử nitrite trên môi trường minimal bổ sung NO2-
trình bày ở hình 22.
Ở nồng độ 10 – 50 mM, đa số các dòng đều phát triển, chỉ một vài dịng khơng phát triển, chứng tỏ dịng này có khả năng khử nitrite. Khả năng khử nitrite của các dòng vi khuẩn vẫn mạnh nhưng giảm dần khi nồng độ tăng dần từ 60 – 100 mM.
31 31 31 29 28 28 24 15 4 0 0 10 20 30 40 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 nồng độ nitrite số dò ng ph át t ri ển
Hình 22. Số dịng vi khuẩn khử nitrite phát triển trên môi trường minimal bổ sung
NO2-
Ở nồng độ 90 mM thì khả năng khử nitrite của các dịng vi khuẩn giảm đáng kể, có 04 dịng chiếm 12,9% phát triển, trong đó có 02 dịng chiếm 6,45% phát triển mạnh 06.O2.1 và 12.O2.1.
Ở nồng độ 100mM, cả 31 dịng đều khơng phát triển khơng có khả năng khử
nitrite ở nồng độ 100mM.
Vi khuẩn T (oxy hóa ammonium, khử nitrate, khử nitrite)
Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn T trên môi trường minimal bổ sung NH4+, NO3-, NO2- trình bày ở hình 23.
Trên môi trường bổ sung NH4+ (100 mM), NO3- (100 mM) và NO2- (10 mM) 40 dòng chiếm 100% đều phát triển. Trong đó có 24 dịng chiếm 60% phát triển mạnh, 12 dòng chiếm 30% phát triển trung bình và 04 dịng chiếm 10% phát triển yếu. Điều này chứng tỏ 40 dịng này đều có khả năng chuyển hóa nitơ. Khả năng chuyển hóa nitơ của 40 dòng vi khuẩn này vẫn còn mạnh nhưng giảm dần khi nồng độ tăng dần.
40 31 4 0 0 10 20 30 40 N1 N2 N3 N4 nồng độ (mM) số dị ng ph át tr iể n
Hình 23. Số dịng vi khuẩn T (oxy hóa ammonium, khử nitrate, khử nitrite) phát triển
trên môi trường minimal bổ sung NH4+, NO3-, NO2-
(N1): [ NH4+ (100 mM), NO3- (100 mM) và NO2- (10 mM)]; N2: [NH4+ (200 mM), NO3- (200 mM) và NO2- (20 mM)]; N3: [NH4+ (300 mM), NO3- (300 mM) và NO2- (30 mM)]; N4: [ NH4+ (400 mM), NO3-
(400 mM) và NO2- (40 mM)]
Bổ sung NH4+
(200 mM), NO3- (200 mM) và NO2- (20 mM) sự phát triển của các dòng vi khuẩn giảm rõ: phát triển mạnh là 08 dòng chiếm 20%, phát triển trung bình là 10 dịng chiếm 25%, phát triển yếu là 13 dịng chiếm 32,5%, khơng phát triển là 09 dòng chiếm 22,5%.
Bổ sung NH4+
(300 mM), NO3- (300 mM) và NO2- (30 mM) khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn giảm đáng kể, chỉ có 04 dịng chiếm 10% phát triển yếu là: 03.T.1, 03.T.2, 07.T.1, 07.T.2.
Bổ sung NH4+ (400 mM), NO3- (400 mM) và NO2- (40 mM) thì 40 dịng vi khuẩn đều khơng phát triển. Điều này chứng tỏ các dòng vi khuẩn khơng có khả năng chuyển hóa nitơ ở nồng độ này.
Kết quả: tuyển chọn được 08 dịng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ tốt, ổn định và có nguồn gốc khác nhau (trong cùng một loại vi khuẩn chuyển hóa nitơ) để thực hiện thí nghiệm tiếp theo là: 12.H4.2, 14.H4.4, 06.O3.1, 14.O3.1, 06.O2.1, 12.O2.1, 03.T.1 và 07.T.1.
A B
C D
Hình 24. Kết quả kiểm tra khả năng phát triển của một số dòng vi khuẩn chuyển hóa
nitơ trên mơi trường minimal bổ sung sung NH4+
, NO3-, NO2-
(ngày 15/01/2012)
A. Sự phát triển của các dịng oxy hóa ammonium trên mơi trường minimal bổ sung NH4+
ở nồng độ 800mM.
B. Sự phát triển của các dịng khử nitrite trên mơi trường minimal bổ sung NO2-
ở nồng độ 80 mM. C. Sự phát triển của các dịng khử nitrate trên mơi trường minimal bổ sung NO3-
ở nồng độ 900 mM. D. Sự phát triển của các dịng T (oxy hóa ammonium, khử nitrite, khử nitrate) trên môi trường
minimal bổ sung NH4+ ( 200mM), NO3- (200 mM), NO2- (20mM).
4.3.3. Kết quả tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P
Xác định các dịng có khả năng tích lũy poly-P
- Kết quả kiểm tra trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn tích lũy poly-P được trình bày ở bảng 21 (phụ lục 3) cho thấy: đa số các dịng vi khuẩn tích lũy poly-P phát triển chậm và yếu trên môi trường tích lũy poly-P. Trong đó có 08/25 dịng chiếm 32,0% khơng phát triển trong ngày đầu tiên. Sau 05 ngày theo dõi thấy có 02/25 dịng chiếm 8,0% phát triển yếu; 13/25 dòng chiếm 52,0% phát triển trung bình và 10 dịng chiếm 40,0% phát triển tốt. 12.H4.4 12.H4.2 14.H4.4 05.H4.4 12.O2.1 6.O2.1 11.O2.4 11.O2.5 06.O3.1 14.O3.1 07.T.1 03.T.1
Chọn được 10 dòng vi khuẩn phát triển tốt (các dòng đánh dấu * ở bảng 21,
phụ lục 3) để so sánh với kết quả kiểm tra trên mơi trường phosphate khó tan.
- Kết quả kiểm tra trên mơi trường phosphate khó tan (được tình bày ở bảng 22 , phụ lục 3) cho thấy: sau 05 ngày theo dõi kết quả cho thấy có 25/25 dịng chiếm 100% đều phát triển. Trong đó, có 07 dịng chiếm 28,0% tạo halo (có khả năng hòa tan phosphate), cịn lại 18 dịng chiếm 72,0% khơng tạo halo (khơng hịa tan phosphate).
Chọn 18 dịng khơng tạo halo (các dòng đánh dấu * ở bảng 22, phụ lục 3) để
thực hiện so sánh với kết quả kiểm tra trên mơi trường tích lũy poly-P.
Hình 25. Sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường ni cấy vi khuẩn tích lũy poly-P
sau 5 ngày (ngày 02/02/2012)
- Dịng 13.L.6 tạo halo có khả năng hịa tan lân.
- Dịng 05.L.4 có phát triển k huẩn lạc nhưng k hơng hịa tan lân.
Hình 26. Sự phát triển của một số dịng vi khuẩn trên mơi trường phosphate khó tan
sau 5 ngày (ngày 17/02/2012)
halo Tích luỹ poly-P 13.L.6 05.L.4 09.L.1 13.L.2 05.L.2 12.L.2 Dòng phát triển
mạnh được chọn Dòng phát triển yếu
Giao giữa 2 kết quả trên chọn được 05 dòng (01.L.1, 04.L.2, 05.L.4, 09.L.1,
13.L.2 – dòng đánh dấu * ở bảng 23, phụ lục 3) phù hợp cả 2 tiêu chí: vừa phát triển
“mạnh” trên mơi trường tích lũy poly-P vừa khơng hịa tan phosphate (khơng tạo halo)
có khả năng tích lũy poly-P cao.
Kết quả đo polyphosphate
Đo hàm lượng poly-P của 05 dịng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P cao. Kết quả thể hiện ở bảng 9.
Bảng 9. Kết quả đo polyphosphate
Stt Tên dòng PO43-(1) (mg/l) PO43-(2) (mg/l) PO43- (mg/l) 1 05.L.4 5,53 14,26 8,73 2 01.L.1 4,29 12,27 7,98 3 04.L.2 5,18 12,07 6,88 4 13.L.2 3,39 9,07 5,68 5 09.L.1 2,14 6,48 4,34
Cả 05 dịng đem đo poly-P đều có lượng polyphosphate tự do cao (1,47 – 4,97 mg/l). Trong đó có 02 dòng tạo poly-P cao là: 01.L.1 (7,98 mg/l) và 05.L.4 (8,72 mg/l). Chọn 02 dòng vi khuẩn tạo poly-P cao nhất để nhận diện và giải trình tự.
4.4. Kết quả nhận diện và phân tích đa dạng di truyền các dịng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P
Nguồn gốc các dòng được chọn để giải trình tự và nhận diện vi khuẩn được trình bày ở bảng 10.
Bảng 10. Các dòng vi khuẩn đem giải trình tự và nguồn gốc
Stt Dòng vi khuẩn Nguồn gốc (phân lập từ môi trƣờng)
1 03.PS.3 Môi trường polysaccharide
2 04.P.1 Môi trường protein
3 12.H4.2 Môi trường ammonium
4 14.H4.4 Môi trường ammonium
5 06.O3.1 Môi trường nitrate
6 14.O3.1 Môi trường nitrate
7 06.O2.1 Môi trường nitrite
8 12.O2.1 Môi trường nitrite
9 03.T.1 Môi trường T (ammonium, nitrate, nitrite) 10 07.T.1 Môi trường T (ammonium, nitrate, nitrite)
11 01.L.1 Mơi trường tích lũy poly-P
12 05.L.4 Mơi trường tích lũy poly-P
4.4.1. Kết quả nhận diện vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
Kết quả điện di sản phẩm PCR
Khi phân tích PCR với cặp mồi tổng 37F và 1479R nhận diện vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, kết quả cả 02 dòng vi khuẩn phân lập đều cho band DNA ở vị trí 1500bp so với thang DNA chuẩn 100bp (hình 27), phù hợp với kết quả nghiên cứu của Jie et al. (2006).
Hình 27. Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của 02 dòng vi khuẩn sản
xuất chất kết tụ sinh học trên gel agarose 1,2% (ngày 15/03/2012).
(1): Thang chuẩn 100bp; (2): 04.P.1; (3): 03.PS.3; (4): đối chứng âm
1500bp
Kết quả giải trình tự và nhận diện vi khuẩn
- Trình tự đoạn 16S rDNA của dòng 03.PS.3
TAAAGCTGAGGTGCTAACATGCAGTCGAGCGACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGG GTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGG ATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAG CTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGG GACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACG GAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGA GTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAA AGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCC ACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTG ACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGT GCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGGAGTACGG TCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAACATGGTGGTTTAATTCGAAG CAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGA CAGAGTGACAGGTGGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAAGGTTGGGGTTAAGTCCCGCAACGA GCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCAT TTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAACCGGAGAAG AGAGGTGGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACCGTGCTACAATGGGAGGGTA CAAAGGGCTGCAAAACCGCGAGGTCAACCAATCCCTTAAACCATTTTCCAT
Accession Description Max
score Total score Query coverage E value Max ident
EU912461.1 Bacillus sp. S uP1 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence 2215 2215 98% 0.0 98%
JN592450.1 Bacillus sp. CRRI-33 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence 2209 2209 98% 0.0 98%
Đoạn DNA của dòng 03.PS.3 dài 1280 bp, có tỉ lệ tương đồng 98% với trình tự DNA của EU912461.1 Bacillus sp. SuP1 và JN592450.1 Bacillus sp. CRRI-33.
- Trình tự đoạn 16S rDNA của dòng 04.P.1
ACAGTCTAGAGGTGCTAACATGCAGTCGAGCGACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGG CGGACGG GTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGG ATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAG CTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGG GACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACG GAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGA GTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC GTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAA GCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCA CGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGA CGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG CTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGGAGTACGGT CGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCA ACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACA GAGTGACAGGTGGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAGGTTGGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGC AACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGCCAACCGGAGAAAAAGG TGGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACCACGTGCTACAATGGAAGGTACAAAGG GCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCAATCCCTAAAACCTTTTCCAGTTCG
Accession Description Max score Total score Query coverage value E Max ident
JF496309.1 Bacillus megaterium strain XAS3-2 16S ribosomal
RNA gene, 2233 2233 99% 0.0 98%
HQ908708.1 Bacillus aryabhattai strain F77063 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence 2233 2233 98% 0.0 99%
FJ976550.1 Bacillus megaterium strain LCR41 16S ribosomal
RNA gene, 2230 2230 99% 0.0 98%
JN215486.1 Bacillus megaterium strain MB1 16S ribosomal
Đoạn DNA của dòng 04.P.1 dài 1280 bp, có tỉ lệ tương đồng 98% với trình tự DNA của HQ908708.1 Bacillus aryabhattai strain F77063 và JN215486.1 Bacillus megaterium strain MB1.
Kết quả nhận diện vi khuẩn cho thấy, 02 dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học thuộc các chi Bacillus. Một số nghiên cứu trên thế giới về khả năng kết tụ sinh học của chi này đã được nhiều tác giả nghiên cứu trong đó có Seo (1993) và Salehizadeh et
al. (2000) như đã đề cập ở lược khảo tài liệu.
Kết quả phân tích đa dạng di truyền
Trình tự 16S rDNA của 02 dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học 03.PS.3 và 04.P.1 được sử dụng để xây dựng cây phả hệ di truyền với trình tự 16S rDNA từ ngân hàng dữ liệu gen của các dòng EU912461.1 Bacillus sp. SuP1, JN592450.1 Bacillus sp. CRRI-33, HQ908708.1 Bacillus aryabhattai strain F77063 và JN215486.1
Bacillus megaterium strain MB1.
Kết quả cây phả hệ di truyền được thể hiện trong hình 28.
HQ908708_Bacillus_aryabhattai_strain_F77063_(INDIA) JN215486_Bacillus_megaterium_strain_MB1_(INDIA) JN592450_Bacillus_sp._CRRI-33_(INDIA) EU912461_Bacillus_sp._SuP1_(INDIA) TRAVINH.KEOTU.04P TRAVINH.KEOTU.PS03 97 0.001
Hình 28. Cây phả hệ di truyền (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ di truyền
giữa các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
(Cây phả hệ dạng Neighbor-Joining tree, xây dựng bằng phần mềm MEGA 5.0)
Cây phả hệ cho thấy 02 dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học 03.PS.3 và 04.P.1 nằm trong hai nhánh khác nhau. Tuy nhiên chúng tương đồng với các dòng EU912461.1 Bacillus sp. SuP1, JN592450.1 Bacillus sp. CRRI-33, HQ908708.1 Bacillus aryabhattai strain F77063 và JN215486.1 Bacillus megaterium strain MB1
(thuộc giống Bacillus). Trong hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey giống Bacillus
04.P.1 03.PS.3
được phân loại như sau: ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillacaea,
chi Bacillus.
4.4.2. Kết quả nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Kết quả điện di sản phẩm PCR
Khi phân tích PCR với cặp mồi tổng 8F và 1492R nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ, kết quả cả 08 dòng vi khuẩn phân lập đều cho band DNA ở vị trí 1500bp so với thang DNA chuẩn 100bp (hình 29), phù hợp với kết quả nghiên cứu của Turner et al.
(1999).
Hình 29. Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi khuẩn
chuyển hóa nitơ trên gel agarose 1,2% (ngày 18/03/2012)
(1): Thang chuẩn 100bp plus; (2):12.H4.2; (3): 14.H4.4; (4): 06.O3.1; (5): 14.O3.1; (6): 06.O2.1; (7): 12.O2.1; (8): 03.T.1; (9): 07.T.1; (10): đối chứng âm
Kết quả giải trình tự và nhận diện vi khuẩn
Kết quả giải trình tự và so sánh trên ngân hàng gen của 08 dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ như sau:
- Trình tự đoạn 16S rDNA của dòng 12.H4.2
GAGCACGCGCGTGCTACACATGCAGTCGACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTG AGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTCGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACC TCGCACCGCATGGTGCGGGGTGGAAAGATTTATCGGTGGGGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTG AGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGAC ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACG CCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTG CAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTA TCCGGATTTA TTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCCGTGAAAGTCCGAGGCTCAACCTCGGATCTGCG GTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGATGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATAT CAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCATTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAG CGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTT TTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAAT TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTT GACATGTGCCAGACCGCCTCAGAAGATGGGGTTTCCCTTCGGGGCTGGTTCACAGGTGGTGCATGGTT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1500 bp
Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident
JQ071518.1 Arthrobacter nicotianae strain YNA111 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence 1808 1808 99% 0.0 99%
EU264108.1 Arthrobacter sp. A-1 16S ribosomal RNA gene,
complete sequence 1803 1803 99% 0.0 99%
EF468655.1 Arthrobacter sp. TD3 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence 1803 1803 99% 0.0 99%
Đoạn DNA của dòng 12.H4.2 dài 1020 bp, có tỉ lệ tương đồng 99% với trình tự DNA của EU264108.1 Arthrobacter sp. A-1 và EF468655.1 Arthrobacter sp. TD3.
- Trình tự đoạn 16S rDNA của dòng 14.H4.4
GTGACATGCGCGTGCTTACACATGCAGTCGACGGAAAGGCCCTGCTTGCAGGGTACTCGAGTGGCGAACGGGT GAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACC ATCGTTTAGTGTCGGTGGTGGAAAGTTTTTCGGTGCAGGATGAGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTA ATGGCCTACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGGACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCC CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTG GGGGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACTCCTTTCAACCATGACGAAGCGTAAGTGACGGTAGTGGTAGAAGAA GCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTA AAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAATTCCGGGGCTTAACTCCGGGCGTGCAGGCGATACGG GCATAACTTGAGTGCTGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAAC ACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGTAGCG AACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGGGTCTTCCACGACTTCTGTGCCGTAGC TAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGGCCC GCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAGAACCTTACCTGGGGCTTGACATATGCCC GGATCGGCGCAAAAGATGCGTTTTTCCCTTTGTGGTCGGGTATACAGGGTGGG
Accession Description Max
score Total