- Mẫu: Chuẩn bị 2 ống nghiệm (loại 20 ml) cho mỗi mẫu (phần 1 và phần 2), cho vào mỗi ống nghiệm lần lượt các thành phần sau:
+ 5 ml nước cất. + 4 ml dung dịch B. + 3 ml nước cất.
+ 0,5 ml dung dịch mẫu
Trộn đều dung dịch trong ống nghiệm trên máy vortex, để ổn định 20 phút tại nhiệt độ phòng. Tiến hành đo OD ở bước sóng 880nm, đo 6 ống nghiệm đường chuẩn, sau đó mới tiến hành đo OD của các mẫu thí nghiệm.
Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (khơng có P2O5, khơng có màu xanh) làm mẫu blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại. 5 ống nghiệm 10, 20, 30, 40, 50 có màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với 5 giá trị OD tăng dần.
- Dựng phương trình đường chuẩn:
Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn Y = a*X + b của P2O5
Trong đó: Y là nồng độ của mẫu (mg/l), X là độ hấp thụ quang (OD)
Dựa vào phương trình đường chuẩn P2O5 và giá trị OD mẫu để tính hàm lượng polyphosphate có trong mẫu (ứng với lượng P2O5) theo công thức: Y = a*X + b
- Từ hàm lượng poly-P có trong mẫu ứng với hàm lượng P2O5 của mỗi phần, tính hàm lượng PO43-
mỗi phần dựa theo cơng thức:
(Trong đó: C là hàm lượng poly-P có trong mẫu tương ứng với hàm lượng P2O5 = 142 ; = 95)
Hàm lượng poly-P nội bào được tính bằng hiệu số giữa PP2 - PP1.
3.3.5. Nhận diện (identification) và phân tích đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P
a. Ly trích DNA vi khuẩn (Breugelmans và Uyttebroek, 2004)
- Ni 12 dịng vi khuẩn đã rịng trong 5ml mơi trường LB qua đêm.
- Chuyển 4ml dịch vi khuẩn sang 2 tuýp 2ml, ly tâm 13000 vòng trong 5 phút để thu sinh khối, loại bỏ phần nước.
- Hòa tan sinh khối của 2 tuýp trong 250µl dung dịch TE pH= 8. - Thêm vào 50 µl SDS 10%.
- Tiếp theo thêm 10µl proteinase K 10mg/ml.
- Đem ủ ở 650 C trong 20 phút, 5 phút đảo ngược tuýp 1 lần.
- Thêm vào 400µl CTAB 10% 0,7M NaCl, ủ ở 650C trong 20 phút.
- Thêm 600µl Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), lắc mạnh (quá trình này thực hiện trong tủ hút), ly tâm 12000 vòng trong 10 phút.
- Chuyển phần dịch trong phía trên (500µl) sang tuýp 1,5ml (thao tác cẩn thận tránh làm vỡ màng ngăn).
- Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Loại bỏ phần nước
- Rửa DNA được với 1ml ethanol 70% (2 lần), mỗi lần rửa sẽ đem ly tâm 12000 vòng trong 5 phút.
- Đem sấy chân không 450C khoảng 15 phút.
- Hồ tan trong 30µl bi nước, trữ trong tủ lạnh ở -200C để chuẩn bị thực hiện phản ứng PCR.
b. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA
Sau khi trích ly DNA, các dòng vi khuẩn sẽ tiến hành phản ứng PCR bằng máy PCR Perkin Elmer PE 9700 khuếch đại đoạn 16S rDNA để nhận diện một số dòng vi khuẩn với các cặp mồi chuyên biệt cho từng loại vi khuẩn.
* Vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
Để nhận diện vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, sử dụng cặp mồi 37F và 1479R khuếch đại trình tự 16S-rDNA được thiết kế (theo Jie et al,. 2006) với trình tự:
Mồi xi 37F 5’ – AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG – 3’ Mồi ngược 1479R 5’ – ACGGCAACCTTGTTACGAGTT – 3’ - Một phản ứng PCR có thể tích 50µl, gồm các thành phần sau: BiH2O 24 µl Buffer NH4+ 5 µl dNTP 8 µl MgCl2 4 µl Mồi xi 37F 2 µl Mồi ngược 1479R 2 µl BSA 0,5 µl Taq polymerase 0,5 µl DNA 4 µl
- Các giai đoạn phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn: + Giai đoạn biến tính ở nhiệt độ 950
C trong 6 phút + Giai đoạn nhân bản: 35 chu kỳ (biến tính: 950
C trong 1 phút 30 giây; bắt cặp: 570C trong 1 phút; kéo dài: 720C trong 1 phút 30 giây)
* Vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Để nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ, sử dụng cặp mồi 8F và 1492R khuếch đại trình tự 16S-rDNA được thiết kế (theo Turner et al., 1999) với trình tự sau:
Mồi xi 8F 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’ Mồi ngược 1492R 5’-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’ - Một phản ứng PCR có thể tích 50 µl, gồm các thành phần sau: BiH2O 24 µl Buffer NH4+ 5µl dNTP 8 µl MgCl2 4 µl Mồi xi 8F 2 µl Mồi ngược 1492R 2 µl BSA 0,5 µl Taq polymerase 0,5 µl DNA 4 µl
- Các giai đoạn phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn: + Giai đoạn biến tính ở nhiệt độ 950
C trong 5 phút + Giai đoạn nhân bản: 30 chu kỳ (biến tính: 950
C trong 30 giây; bắt cặp: 550C trong 30 giây; kéo dài: 720C trong 1 phút 30 giây)
+ Giai đoạn hoàn tất ở 720
C trong 10 phút, 10oC trong .
* Vi khuẩn tích lũy poly-P
Để nhận diện vi khuẩn tích lũy poly-P, sử dụng cặp mồi 27F và 1492R khuếch đại trình tự 16S-rDNA được thiết kế (theo Kim et al., 2010) với trình tự sau:
Mồi xi 27F 3’ –AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG- 5’ (M là A hoặc T) Mồi ngược 1492R 3’ –ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT- 5’
- Một phản ứng PCR có thể tích 50 µl, gồm các thành phần sau: BiH2O 24 µl Buffer NH4+ 5 µl dNTP 8 µl MgCl2 4 µl Mồi xi 27F 2 µl Mồi ngược 1492R 2 µl BSA 0,5 µl Taq polymerase 0,5 µl DNA 4 µl
- Các giai đoạn phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn: + Giai đoạn biến tính ở nhiệt độ 950
C trong 5 phút. + Giai đoạn nhân bản: 30 chu kỳ (biến tính: 950
C trong 1 phút; bắt cặp: 570C trong 45 giây; kéo dài: 720C trong 1 phút 30 giây).
+ Giai đoạn hoàn tất ở 720C trong 7 phút, 10oC trong .
c. Điện di trên gel agarose để phát hiện sản phẩm PCR
Các sản phẩm sau khi đã khuếch đại bằng phản ứng PCR sẽ tiếp tục được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,2 % có bổ sung ethidium bromide (EtBr 0,5 mg/l). Nhằm so sánh kích thước DNA của sản phẩm PCR với thang DNA chuẩn và kiểm tra độ tinh sạch của DNA. Qui trình thực hiện như sau:
* Chuẩn bị gel: Cân 0,48g agarose cho vào bình tam giác đựng 40ml dung dịch TAE 1X, dùng lị vi sóng đun hỗn hợp trong 3 phút cho agarose tan hoàn toàn. Lấy ra để nguội khoảng 10 phút, bổ sung 800µl ethidium bromide và lắc nhẹ cho đều. Sau đó đổ nhẹ dung dịch agarose vào khn để định hình gel (khi đổ gel phải đổ dứt khốt để tránh bọt khí làm ảnh hưởng đến sự điện di sản phẩm PCR).
* Điện di: Đặt agarose gel đã được định hình vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE 1X, load 10µl mẫu sản phẩm PCR của DNA đã được trộn với 2µl loading buffer vào giếng trên gel agarose. Tiến hành điện di trên gel ở hiệu điện thế 95 volt trong 45 phút.
* Quan sát các băng (band) DNA trên gel bằng hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 để nhận diện các dòng vi khuẩn bằng cách quan sát các băng xuất hiện trên gel, so sánh kích thước DNA của sản phẩm PCR với thang DNA chuẩn.
d. Giải trình tự DNA các dòng vi khuẩn
- Mẫu sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng kỹ thuật điện di được gởi giải trình tự bằng mồi xi (mồi tiến hành PCR cho từng loại vi khuẩn) tại Công ty Macrogen ở Hàn Quốc.
- Trình tự 16S rDNA của các dòng vi khuẩn được so sánh với các trình tự 16S rDNA trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm BLAST N để xác định mức độ tương đồng của các dịng vi khuẩn đó với các dịng vi khuẩn trong ngân hàng gen. Các bước thực hiện:
+ Vào trang web của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). + Chọn BLAST/nucleotide blast/
+ Upload file trình tự 16S của từng dòng vi khuẩn. Chọn BLAST. + Ghi nhận kết quả.
e. Xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm MEGA 5.0
- Tạo file chứa các trình tự vi khuẩn phân lập và vi khuẩn được chọn ở bước BLAST bằng công cụ Notepad với chấm đuôi txt.
- Định dạng fasta với phần mềm BioEdit - Mở file fasta bằng phần mềm MEGA 5.05 - Tiến hành Alignment (Align by ClustalW)
- Click Data/ phylogenetic analysis. Click phylogeny (vẽ cây phả hệ) - Chọn Construct/ Test neighbor joining tree
- Chọn Boostrap method và 1000 lần lặp lại.
- Click Compute, chờ xuất hiện cây phả hệ và sử dụng chỉ số boostrap để đánh giá cây phả hệ.
Q trình tiến hành thí nghiệm có thể được tóm tắt như sau (hình 11): Thu mẫu chất thải từ trại heo (sau biogas)
Đo pH mẫu chất thải
Pha loãng, nhỏ giọt mẫu nước thải trên các môi trường
Phân lập, làm thuần, quan sát hình dạng vi khuẩn, mơ tả đặc điểm khuẩn lạc
Khảo sát hoạt tính của các dịng vi khuẩn phân lập được
Giải trình tự và nhận diện vi khuẩn
Phân tích sự đa dạng di truyền vi khuẩn
CHƢƠNG IV.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân tích mẫu
Tổng số mẫu chất thải thu từ trại chăn nuôi heo (sau biogas) tại các huyện tỉnh Trà Vinh là 14 mẫu, tất cả các mẫu đều ở dạng chất lỏng. Số mẫu chất thu được từ các huyện thể hiện ở bảng 6 và nguồn gốc các mẫu được trình bày ở bảng 11 (phụ lục 1).
Bảng 6. Số mẫu chất thải thu đƣợc từ các huyện tỉnh Trà Vinh
STT Địa điểm thu mẫu Số mẫu
1 Châu Thành 2 2 Càng Long 2 3 Cầu kè 3 4 Trà cú 1 5 Cầu Ngang 3 6 Tiểu Cần 3
Kết quả đo pH các mẫu chất thải được trình bày ở hình 12.
7.67 6.19 7.93 5.88 5.61 7.06 6.82 7.14 7.04 6.24 6.6 6.45 6.92 5.62 4 5 6 7 8 9 H.1 H.2 H.3 H.4 H.5 H.6 H.7 H.8 H.9 H.10 H.11 H.12 H.13 H.14 mẫu chất thải pH
Hình 12. Kết quả đo pH các mẫu chất thải
Theo Trương Quốc Phú và Vũ Ngọc Út (2006) pH là một trong những nhân tố mơi trường có ảnh hưởng đến đời sống thủy sinh vật. pH thích hợp là 6,5 – 9, pH mơi trường nước quá cao hay quá thấp đều không thuận lợi cho quá trình phát triển của chúng. Nếu giá trị độ pH quá thấp, nước chua quá giới hạn cho phép thường có nhiều khí CO2, thiếu dưỡng khí O2, mặt khác các vi khuẩn, tảo độc có hại trong mơi trường yếm khí phát triển thuận lợi, nhiều vi sinh vật gây bệnh cũng phát triển. Môi trường
nước kiềm cao (giá trị độ pH > 9) quá ngưỡng cho phép cũng khơng thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của các loài thủy sinh vật.
Kết quả đo pH cho thấy, 14 mẫu chất thải có pH trong khoảng 5,61 – 7,93, 08 mẫu có pH nằm trong khoảng 6,5 - 9, 06 mẫu có pH dưới mức pH 6,5, điều này chứng tỏ chất lượng nước thải trại chăn nuôi heo (sau biogas) của một số mẫu chất thải thu thập ở tỉnh Trà Vinh dưới mức an tồn, có thể có nguy cơ gây hại cho thủy sinh vật.
Kết quả đếm mật số vi khuẩn được trình bày ở bảng 12 (phụ lục 1) và hình 13.
5.54 5.7 5.52 6.3 5.96 5.99 5.47 5.13 4.81 5.12 6.08 4.99 5.57 5.51 4 5 6 7 H.1 H.2 H.3 H.4 H.5 H.6 H.7 H.8 H.9 H.10 H.11 H.12 H.13 H.14 mẫu chất thải m ật s ố ( lo g cf u /m l)
Hình 13. Mật số vi khuẩn trung bình các mẫu chất thải
Thành phần vi khuẩn trong các mẫu chất thải khá đa dạng phong phú, hầu hết tất cả các mẫu chất thải đều hiện diện các loại vi khuẩn như: vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P. Mật số từng loại vi khuẩn được trình bày ở bảng 12 (phụ lục 1).
Mật số trung bình các mẫu chất thải trong khoảng từ 4,81 log10cfu/ml (H.09) - 6,30 log10cfu/ml (H.04), cụ thể từng mẫu chất thải ở hình 13.
4.2. Kết quả phân lập
Từ 14 mẫu chất thải phân lập được 188 dòng vi khuẩn, trong đó có 28 dịng vi khuẩn phân lập từ môi trường sản xuất chất kết tụ sinh học, 135 dòng vi khuẩn phân lập từ mơi trường chuyển hóa nitơ và 25 dịng vi khuẩn phân lập từ mơi trường tích lũy poly-P. Kết quả cụ thể như sau:
4.2.1. Kết quả phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
28 dịng vi khuẩn có khả năng sản xuất chất kết tụ sinh học, trong đó có 15 dịng phân lập từ môi trường sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide (chiếm 53,57%) và 13 dịng từ mơi trường sản xuất chất kết tụ sinh học protein (chiếm 46,43%). Nguồn gốc 28 dòng vi khuẩn phân lập được trình bày ở bảng 13 (phụ lục 2). Đặc điểm của khuẩn lạc và đặc điểm tế bào vi khuẩn được trình bày ở bảng 14 (phụ lục 2).
Đặc điểm của khuẩn lạc
Hầu hết các khuẩn lạc có dạng trịn, màu trắng đục hay trắng sữa, bề mặt khuẩn lạc mơ, bìa ngun, đường kính khuẩn lạc tương đối lớn sau 24 giờ nuôi cấy. Cụ thể:
- Màu sắc của khuẩn lạc: 11/28 dòng chiếm 39,29% màu trắng đục; 16/28 dịng chiếm 57,14% có màu trắng sữa và 01 dịng chiếm 3,57% có màu tím sen.
- Hình dạng khuẩn lạc: 26/28 dòng chiếm 92,86% dạng tròn và 02 dòng chiếm 7,14% dạng không đều.
- Dạng bìa khuẩn lạc: 27/28 dịng chiếm 96,43% dạng bìa nguyên và 01/28 dòng chiếm 3,57% dạng bìa răng cưa.
- Độ nổi khuẩn lạc: 26/28 dòng chiếm 92,86% độ nổi mô và 02 dịng chiếm 7,14% có dạng lài.
- Kích thước khuẩn lạc: Đường kính trung bình khuẩn lạc khoảng 1,4 – 5 mm, cụ thể: 13 dịng chiếm 46,43% có đường kính nhỏ hơn 2 mm, 15 dịng chiếm 53,57% có đường kính lớn hơn 2 mm.
Đặc điểm của tế bào vi khuẩn
- Hình dạng tế bào vi khuẩn: Hầu hết các dòng vi khuẩn có dạng que ngắn 22/28 dịng chiếm 78,57%; một số dạng que dài 06/28 dòng chiếm 21,43%.
- Khả năng chuyển động: Đa số có khả năng chuyển động 20/28 dòng chiếm 71,43%; một số khơng chuyển động 08/28 dịng chiếm tỉ lệ 28,57%.
Đặc điểm một số khuẩn lạc vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học được trình bày ở hình 14.
Hình 14. Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
(ngày 25/07/2012)
A: Dòng 05.PS.3 khuẩn lạc trịn, màu tím sen, ngun, mơ B: Dịng 04.P.1 khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, ngun, mơ C: Dịng 12.P.1 khuẩn lạc trịn, màu trắng sữa, ngun, mơ D: Dòng 08.PS.1 khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, nguyên, mơ
Chụp dưới kính hiển vi điện tử quét JSM 5500 cho thấy dịng 03.PS.3 có dạng hình que ngắn (hình 15).
Hình 15. Hình dạng dịng vi khuẩn 03.PS.3 chụp dưới kính hiển vi điện tử quét ở độ
phóng đại 12000 lần (ngày 15/05/2012)
A B
4.2.2. Kết quả phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Trong 135 dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ có 33 dịng chiếm 24,4% phân lập trên môi trường ammonium, 31 dịng chiếm 23% phân lập trên mơi trường nitrate, 31 dòng chiếm 23% phân lập trên mơi trường nitrite và 40 dịng chiếm 29,6% phân lập trên môi trường T (ammonium, nitrate và nitrite).
Nguồn gốc các dịng vi khuẩn được trình bày ở bảng 15 (phụ lục 2). Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào vi khuẩn được mô tả ở bảng 7 và bảng 16 (phụ lục 2).
Đặc điểm của khuẩn lạc
Thời gian trung bình để các dịng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường minimal là 48 giờ.
- Màu sắc khuẩn lạc: Đa số khuẩn lạc màu trắng đục 76 dòng chiếm 56,30% hay trắng sữa 32 dịng chiếm 23,70%; ngồi ra cịn có dạng màu vàng nhạt 06 dòng chiếm 4,44%; nâu nhạt 08 dòng chiếm 5,93%; trắng ngã vàng 09 dòng chiếm 6,67%; hồng nhạt 01 dòng chiếm 0,74%; cam nhạt 02 dòng chiếm 1,48%.