CHƢƠNG III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.4. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học,
hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P
a. Tuyển chọn vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
Mục đích: Kiểm tra hiệu quả kết tụ của các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học phân lập được nhằm xác định tỉ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, từ đó chọn ra 01 dịng vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao nhất ở mỗi loại mơi trường để giải trình tự và nhận diện vi khuẩn.
* Quy trình thực hiện
Sử dụng kaolin để kiểm tra khả năng kết tụ sinh học của những dòng vi khuẩn phân lập được.
- Nuôi cấy vi khuẩn trong ống falcon có 10ml mơi trường nuôi cấy vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học lỏng, nuôi lắc liên tục 4 ngày, ở 300
C (hình 8).
Hình 8. Vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học được nuôi trong ống Falcon
(ngày 18/10/2011)
- Cho vào ống nghiệm: 18ml kaolin (5g/l) + 2ml dung dịch CaCl2 (1g/l) + 20µl dung dịch vi khuẩn (mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn).
- Để yên 5 phút.
- Khả năng kết tụ sinh học của các dòng vi khuẩn được tính theo cơng thức:
Tỉ lệ kết tụ =
b. Tuyển chọn các vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Mục đích: Khảo sát khả năng oxy hóa ammonium, khử nitrate và khử nitrite của các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ. Từ đó chọn lọc ra 02 dòng phát triển tốt và ổn định ở từng môi trường để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
Khả năng oxy hóa ammonium, khử nitrate và khử nitrite của các dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ thể hiện thông qua sự phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường minimal bổ sung:
- NH4+ dưới dạng NH4Cl (vi khuẩn oxy hóa ammonium) qua các nồng độ tăng dần từ 100 – 900 mM.
- NO3- dưới dạng NaNO3 (vi khuẩn khử nitrate) qua các nồng độ tăng dần từ 100– 1000 mM.
- NO2- dưới dạng NaNO2 (vi khuẩn khử nitrite) qua các nồng độ tăng dần từ 10– 100 mM.
- Đồng thời NH4+, NO3- và NO2- (vi khuẩn T - oxy hóa ammonium, khử nitrate, khử nitrite) qua các nồng độ:
(A) NH4+ (100 mM), NO3- (100 mM), NO2- (10 mM). (B) NH4+ (200 mM), NO3- (200 mM), NO2- (20 mM). (C) NH4+ (300 mM), NO3- (300 mM), NO2- (30 mM). (D) NH4+ (400 mM), NO3- (400 mM), NO2- (40 mM).
Tiến hành cấy: Dùng que cấy hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, chạm đầu que cấy vào ống nghiệm chứa các dòng vi khuẩn đã rịng, cấy trên mơi trường minimal bổ sung NH4+, NO3-, NO2-, ủ trong tủ ủ ở 30oC, ghi nhận kết quả sau khi ủ 48 giờ.
ODđối chứng - ODmẫu
x 100%
A. Phát triển yếu B. Phát triển trung bình C. Phát triển tốt
Hình 9. Xác định khả năng phát triển của vi khuẩn (ngày 27/12/2011)
Đánh giá khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn ở các mức độ:
- Dòng không phát triển (-), là dịng khơng có khả năng chuyển hóa mơi trường đó.
- Dịng phát triển yếu (+), là dòng có khả năng chuyển hóa thấp (hình 9A).
- Dịng phát triển trung bình (++), là dịng có khả năng chuyển hóa trung bình (hình 9B).
- Dịng phát triển mạnh (+++) là dịng có khả năng chuyển hóa tốt (hình 9C). Trên từng môi trường, ở mỗi nồng độ chọn ra những dòng phát triển để tiếp tục khảo sát ở nồng độ cao hơn. Từ đó tìm ra được những dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ tốt và ổn định từ nồng độ thấp đến nồng độ cao ở từng mơi trường.
c. Tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P
Mục đích: chọn 02 dịng vừa phát triển tốt trên mơi trường ni cấy vi khuẩn tích lũy poly-P vừa khơng hịa tan phosphate khó tan và có hàm lượng polyphosphate cao nhất để tiến hành hành thí nghiệm tiếp theo.
* Xác định khả năng phát triển của vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn tích lũy poly-P (Wang et al., 2008)
Xác định khả năng tích lũy poly-P trên mơi trường tích lũy poly-P có bổ sung 2% agar và quan sát trong 5 ngày. Chọn những dịng có khả năng phát triển tốt, loại bỏ những dịng khơng phát triển trong ngày đầu và dòng phát triển yếu hay trung bình (sau 05 ngày theo dõi). Khả năng phát triển mạnh hay yếu của các dịng vi khuẩn tích lũy poly-P được đánh giá tương tự vi khuẩn chuyển hóa nitơ (hình 9).
* Xác định khả năng hòa tan phosphate trên mơi trường phosphate khó tan (Nautiyal, 1999)
Để nhận diện nhanh vi khuẩn tích lũy poly-P, sử dụng mơi trường phosphate khó tan có chất chỉ thị pH Bromothymol Blue 0,5% (w/v) trong môi trường, nếu vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P thì khơng làm giảm màu xanh của chất chỉ thị do khơng có acid hữu cơ do vi khuẩn tổng hợp tạo ra làm pH giảm, đồng thời không tạo “halo”. Tiến hành quan sát 2 lần, mỗi lần cách nhau 2 ngày, chọn ra những dòng vi khuẩn không phát triển trên mơi trường phosphate khó tan hoặc phát triển nhưng không tạo “halo”.
Xác định khả năng tích lũy poly-P của các dòng vi khuẩn phân lập bằng cách giao kết quả của 2 lần kiểm tra trên, chọn các dòng phù hợp với 2 chỉ tiêu lựa chọn: phát triển tốt trên mơi trường tích lũy poly-P và khơng hịa tan phosphate.
* Xác định hàm lượng poly-P (Eixler et al., 2005)
Ly trích poly-P
Ni vi khuẩn trong chai ampicillin chứa 4 ml mơi trường tích lũy poly-P, lắc 160 vòng/phút. Sau 6 ngày ni, tiến hành ly tâm 12000 vịng/phút trong 5 phút để thu sinh khối, loại bỏ phần nước dịch. Hòa tan sinh khối trong 4 ml dung dịch NaOH 0,2N, ủ trong 20 giờ để ly trích poly-P. Dịch tế bào được lọc qua giấy lọc Sartorius Stedim 17598, 0,45 m, CE để loại bỏ xác tế bào. Thu dịch lọc chứa poly-P. Chia dịch
lọc làm 02 phần (mỗi phần 2ml):
- Phần 1 được đem đo để xác định lượng phosphate tự do (PP1) trong dung dịch bằng phương pháp Molypdate blue (so màu ở bước sóng 880nm trên máy Beckman Coulter DU 640B).
- Phần 2 được thủy phân bằng HCl 1M ở 100oC, 10 phút. Dịch thủy phân sau đó để nguội và đem đo hàm lượng phosphate (PP2) với phương pháp như phần 1.
Hàm lượng poly-P nội bào được tính bằng hiệu số giữa PP2 - PP1.
Đo poly-P bằng phương pháp Molypdate blue (so màu ở bước sóng 880nm
trên máy Beckman Coulter DU 640B)
- Dựng đường chuẩn P2O5: gồm 06 ống nghiệm (loại 20ml), đánh số thứ tự từ 0, 10, 20, 30, 40, 50 tương ứng với hàm lượng P2O5 trong ống, lần lượt thêm vào mỗi ống các thành phần ở bảng 5.
Bảng 5. Thành phần của dãy đƣờng chuẩn P2O5 Ống nghiệm Hóa chất 0 10 20 30 40 50 Nước cất (ml) 5 5 5 5 5 5 Dung dịch A (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Dung dịch B (ml) 4 4 4 4 4 4 Nước cất (ml) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 Hàm lượng P2O5/1 ống (mg/l) 0 10 20 30 40 50 Tiến hành vortex các ống nghiệm và để ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra theo nguyên tắc hàm lượng P2O5 càng cao thì màu xanh càng đậm dần (hình 10).
Hình 10. Đường chuẩn đo poly-P (ngày 16/02/2012)
- Mẫu: Chuẩn bị 2 ống nghiệm (loại 20 ml) cho mỗi mẫu (phần 1 và phần 2), cho vào mỗi ống nghiệm lần lượt các thành phần sau:
+ 5 ml nước cất. + 4 ml dung dịch B. + 3 ml nước cất.
+ 0,5 ml dung dịch mẫu
Trộn đều dung dịch trong ống nghiệm trên máy vortex, để ổn định 20 phút tại nhiệt độ phòng. Tiến hành đo OD ở bước sóng 880nm, đo 6 ống nghiệm đường chuẩn, sau đó mới tiến hành đo OD của các mẫu thí nghiệm.
Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (khơng có P2O5, khơng có màu xanh) làm mẫu blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại. 5 ống nghiệm 10, 20, 30, 40, 50 có màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với 5 giá trị OD tăng dần.
- Dựng phương trình đường chuẩn:
Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn Y = a*X + b của P2O5
Trong đó: Y là nồng độ của mẫu (mg/l), X là độ hấp thụ quang (OD)
Dựa vào phương trình đường chuẩn P2O5 và giá trị OD mẫu để tính hàm lượng polyphosphate có trong mẫu (ứng với lượng P2O5) theo công thức: Y = a*X + b
- Từ hàm lượng poly-P có trong mẫu ứng với hàm lượng P2O5 của mỗi phần, tính hàm lượng PO43-
mỗi phần dựa theo cơng thức:
(Trong đó: C là hàm lượng poly-P có trong mẫu tương ứng với hàm lượng P2O5 = 142 ; = 95)
Hàm lượng poly-P nội bào được tính bằng hiệu số giữa PP2 - PP1.