CHƢƠNG III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1. Dụng cụ, thiết bị
- Vá thu mẫu, keo nhựa đựng mẫu, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, bình tam giác, lam, lamen, tube 1,5ml, ống falcon, giấy lọc (Sartorius Stedim 17598, 0,45m, CE),
chai ampicillin…
- Máy chụp ảnh kỹ thuật số Sony Cyber-shot 8.0 (Nhật Bản) - Kính hiển vi Olympus CH-2 (Nhật Bản)
- pH kế Orion 420A (Mỹ)
- Kính hiển vi điện tử quét JSM 5500 (Nhật Bản) - Cân điện tử Sartorius TE 612 (Đức)
- Tủ sấy EHRET (Đức), tủ hút, máy trộn mẫu Vortex - Tủ cấy vi sinh vật Flow Cabinet 125B-81804 (Pháp) - Tủ ủ vi sinh vật Incucell 55 (Đức)
- Tủ lạnh trữ mẫu Hitachi (Nhật Bản), Sharp, Deawoo (Hàn Quốc) - Tủ lạnh trữ mẫu -200C Sanyo (Nhật Bản)
- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
- Bộ micropipet Gibson P10, P20, P50, P200, P1000 (Đức)
- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbinternational (Đức), Tuttnauer 3870 MLV (Đức) - Lò vi sóng Panasonic NN-GX 36WF (Thái Lan)
- Máy li tâm Biofuge pico Heraus D-37520 Osterode (Đức) - Nồi ủ cách thủy GFL 1083 (Đức)
- Máy sấy chân không Eppendorf Concentrator 5301 (Đức) - Máy đo OD Beckman Coulter DU 640B (Đức)
- Bộ điện di một chiều BioRad (Mỹ)
- Máy đọc và chụp hình gel Bio-Rad Universal HoodII (Mỹ) - Máy PCR Perkin Elmer 9700 (Hoa Kỳ)
- Máy PCR Bio-Rad DNA Engine (Mỹ)
- Máy giải trình tự DNA tự động ABI PRISM 3130 XL (Mỹ) - Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu
3.2.2. Nguyên vật liệu
Mẫu chất thải thu từ trại chăn nuôi heo (sau giai đoạn biogas) ở tỉnh Trà Vinh (hình 4).
Hình 4. Mẫu chất thải trại heo sau biogas (ngày 25/05/2011)
A. Mẫu chất thải H.06 thu tại ấp Ngãi Hiệp, xã Hưng Mỹ, Châu Thành B.Mẫu chất thải H.09 thu tại ấp Giồng Bèn, xã Huyền Hội, Càng Long
3.2.3. Hóa chất
a. Hóa chất dùng cho phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
Glucose, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaCl, carbamide, L-acid glutamic, yeast extract, (NH4)2SO4, CaCl2, NH4Cl, NaNO2, NaNO3, pepton, agar…
b. Hóa chất dùng để tuyển chọn vi khuẩn
* Tuyển chọn vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học dùng: kaolin, CaCl2. * Tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa nitơ dùng: NH4Cl, NaNO2, NaNO3. *Tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P dùng:
- (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, MgCl2, KCl2, Ca3(PO4)2, Bromothymol Blue… - Hóa chất đo polyphosphate: NaOH 0,2N, HCl 1M, dung dịch A, dung dịch B.
Dung dịch A gồm:
+ 140 ml acid sunfuric đậm đặc (H2SO4 ) vào 1000 ml nước cất để nguội (1)
+ 12 g amonium molypdate (NH4)6Mo2O24. 4H2O vào 25 ml nước cất đun nóng cho tan (2)
+ 0,2908 g Potasssium antymonyl tartrate (KSbC4H2O6 ) vào 100 ml nước cất (3). + Trộn (1), (2), (3) và thêm nước cất cho đủ 2 lít.
Dung dịch B gồm: 1,050 acid ascorbic + 200 ml dung dịch A. c. Hóa chất dùng để trích DNA vi khuẩn
Mơi trường Luria Bertani (LB), TE pH8, sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%, isopropanol, ethanol 70%, hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10%, NaCl 0,75 M, proteinase K (10mg/ml), chloroform: isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1), bi-H2O.
d. Hóa chất dùng trong phản ứng PCR nhận diện vi khuẩn
Bi nước, buffer NH4+
, MgCl2 25mM, deoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs), mồi xuôi và mồi ngược, BSA (Bovine Serum Albumin Acetylated 10mg/ml), Taq
DNA polymerase, DNA mẫu.
e. Hóa chất điện di để phát hiện sản phẩm PCR
Agarose, TAE buffer, loading buffer, ethidium bromide (EtBr), thang chuẩn DNA 100bp plus.
3.2.4. Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn
- Theo Deng et al. (2003) thành phần môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide như sau:
Glucose 10 g/l KH2PO4 5 g/l K2HPO4 0,2 g/l MgSO4.7H2O 0,1 g/l NaCl 0,1 g/l Carbamide 0,5 g/l Yeast extract 0,5 g/l
Agar 20 g/l (bổ sung trong môi trường thạch)
- Theo Hazana et al. (2008) thành phần môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
sản xuất chất kết tụ sinh học protein như sau:
Glucose 20 g/l
L- Acid glutamic 50 g/l
MgSO4.7H2O 0,5 g/l
Yeast extract 0,5 g/l
Agar 20 g/l (bổ sung trong môi trường thạch)
pH 7,0 chỉnh bằng NaOH
- Theo Zhao et al. (2010), môi trường minimal được dùng phân lập vi khuẩn
chuyển hóa nitơ gồm các thành phần như bảng 4.
Bảng 4. Thành phần môi trƣờng minimal phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
( a) Mơi trường tổng hợp 3 loại nitơ (ammonium, nitrate, nitrite)
( b) 1 lít khống vi lượng: 3g MgSO4.7H2O, 1g MnSO4, 1,12g H3BO3, 0,3g FeSO4.7H2O, 0,6g CaCl2. Hóa chất Mơi trƣờng ammonium Môi trƣờng nitrate Môi trƣờng nitrite Môi trƣờng T(a) NH4Cl (g/l) 0,12 0,12 NaNO3 (g/l) 0,04 0,04 NaNO2 (g/l) 0,04 0,04 NaCl (g/l) 4 4 4 4 Na2HPO4.12H2O (g/l) 21,5 21,5 21,5 21,5 KH2PO4 (g/l) 0,9 0,9 0,9 0,9 Khoáng vi lượng(b) ml/l 3 3 3 3 Glucose (g/l) 3 1 1 2 Agar (g/l) 20 20 20 20
- Theo Wang et al. (2008), môi trường phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P gồm các thành phần như sau: Glucose 10 g/l NH4Cl 0,02 g/l KH2PO4 87,74 mg/l Pepton 0,02 g/l MgSO4.7H2O 0,01 g/l CaCl2 0,005 g/l Khoáng vi lượng 0,5 ml/l
Agar 20 g/l (bổ sung trong môi trường thạch)
pH 7,0 chỉnh bằng NaOH
Khoáng vi lượng: FeCl3. 6H2O(1,5 g/l), H3BO3 (0,15 g/l), CuSO4. 5H2O (0,03 g/l), KI (0,18 g/l), MnCl2. 4H2O (0,12 g/l), Na2MoO4. 2H2O (0,06 g/l), ZnSO4. 7H2O (0,12 g/l), CoCl2. 6H2O (0,15 g/l), EDTA (10 g/l) (Smolders et al., 1994).
- Theo Nautiyal (1999), môi trường phosphate khó tan dùng để kiểm tra khả năng hòa tan phosphate của các dịng vi khuẩn tích lũy poly-P như sau:
Glucose 10 g/l NH4)2SO4 0,1 g/l MgSO4.7H2O 0,25 g/l MgCl2 5 g/l KCl 0,2 g/l Ca3(PO4)2 5 g/l Bromothymol Blue 5 ml/l Agar 20 g/l pH 7,2 - 8 chỉnh bằng KOH 0,1M.