Hình 4. Mẫu chất thải trại heo sau biogas (ngày 25/05/2011)
A. Mẫu chất thải H.06 thu tại ấp Ngãi Hiệp, xã Hưng Mỹ, Châu Thành B.Mẫu chất thải H.09 thu tại ấp Giồng Bèn, xã Huyền Hội, Càng Long
3.2.3. Hóa chất
a. Hóa chất dùng cho phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
Glucose, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaCl, carbamide, L-acid glutamic, yeast extract, (NH4)2SO4, CaCl2, NH4Cl, NaNO2, NaNO3, pepton, agar…
b. Hóa chất dùng để tuyển chọn vi khuẩn
* Tuyển chọn vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học dùng: kaolin, CaCl2. * Tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa nitơ dùng: NH4Cl, NaNO2, NaNO3. *Tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P dùng:
- (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, MgCl2, KCl2, Ca3(PO4)2, Bromothymol Blue… - Hóa chất đo polyphosphate: NaOH 0,2N, HCl 1M, dung dịch A, dung dịch B.
Dung dịch A gồm:
+ 140 ml acid sunfuric đậm đặc (H2SO4 ) vào 1000 ml nước cất để nguội (1)
+ 12 g amonium molypdate (NH4)6Mo2O24. 4H2O vào 25 ml nước cất đun nóng cho tan (2)
+ 0,2908 g Potasssium antymonyl tartrate (KSbC4H2O6 ) vào 100 ml nước cất (3). + Trộn (1), (2), (3) và thêm nước cất cho đủ 2 lít.
Dung dịch B gồm: 1,050 acid ascorbic + 200 ml dung dịch A. c. Hóa chất dùng để trích DNA vi khuẩn
Mơi trường Luria Bertani (LB), TE pH8, sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%, isopropanol, ethanol 70%, hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10%, NaCl 0,75 M, proteinase K (10mg/ml), chloroform: isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1), bi-H2O.
d. Hóa chất dùng trong phản ứng PCR nhận diện vi khuẩn
Bi nước, buffer NH4+
, MgCl2 25mM, deoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs), mồi xuôi và mồi ngược, BSA (Bovine Serum Albumin Acetylated 10mg/ml), Taq
DNA polymerase, DNA mẫu.
e. Hóa chất điện di để phát hiện sản phẩm PCR
Agarose, TAE buffer, loading buffer, ethidium bromide (EtBr), thang chuẩn DNA 100bp plus.
3.2.4. Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn
- Theo Deng et al. (2003) thành phần môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide như sau:
Glucose 10 g/l KH2PO4 5 g/l K2HPO4 0,2 g/l MgSO4.7H2O 0,1 g/l NaCl 0,1 g/l Carbamide 0,5 g/l Yeast extract 0,5 g/l
Agar 20 g/l (bổ sung trong môi trường thạch)
- Theo Hazana et al. (2008) thành phần môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
sản xuất chất kết tụ sinh học protein như sau:
Glucose 20 g/l
L- Acid glutamic 50 g/l
MgSO4.7H2O 0,5 g/l
Yeast extract 0,5 g/l
Agar 20 g/l (bổ sung trong môi trường thạch)
pH 7,0 chỉnh bằng NaOH
- Theo Zhao et al. (2010), môi trường minimal được dùng phân lập vi khuẩn
chuyển hóa nitơ gồm các thành phần như bảng 4.
Bảng 4. Thành phần môi trƣờng minimal phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
( a) Mơi trường tổng hợp 3 loại nitơ (ammonium, nitrate, nitrite)
( b) 1 lít khống vi lượng: 3g MgSO4.7H2O, 1g MnSO4, 1,12g H3BO3, 0,3g FeSO4.7H2O, 0,6g CaCl2. Hóa chất Mơi trƣờng ammonium Môi trƣờng nitrate Môi trƣờng nitrite Môi trƣờng T(a) NH4Cl (g/l) 0,12 0,12 NaNO3 (g/l) 0,04 0,04 NaNO2 (g/l) 0,04 0,04 NaCl (g/l) 4 4 4 4 Na2HPO4.12H2O (g/l) 21,5 21,5 21,5 21,5 KH2PO4 (g/l) 0,9 0,9 0,9 0,9 Khoáng vi lượng(b) ml/l 3 3 3 3 Glucose (g/l) 3 1 1 2 Agar (g/l) 20 20 20 20
- Theo Wang et al. (2008), môi trường phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P gồm các thành phần như sau: Glucose 10 g/l NH4Cl 0,02 g/l KH2PO4 87,74 mg/l Pepton 0,02 g/l MgSO4.7H2O 0,01 g/l CaCl2 0,005 g/l Khoáng vi lượng 0,5 ml/l
Agar 20 g/l (bổ sung trong môi trường thạch)
pH 7,0 chỉnh bằng NaOH
Khoáng vi lượng: FeCl3. 6H2O(1,5 g/l), H3BO3 (0,15 g/l), CuSO4. 5H2O (0,03 g/l), KI (0,18 g/l), MnCl2. 4H2O (0,12 g/l), Na2MoO4. 2H2O (0,06 g/l), ZnSO4. 7H2O (0,12 g/l), CoCl2. 6H2O (0,15 g/l), EDTA (10 g/l) (Smolders et al., 1994).
- Theo Nautiyal (1999), môi trường phosphate khó tan dùng để kiểm tra khả năng hòa tan phosphate của các dịng vi khuẩn tích lũy poly-P như sau:
Glucose 10 g/l NH4)2SO4 0,1 g/l MgSO4.7H2O 0,25 g/l MgCl2 5 g/l KCl 0,2 g/l Ca3(PO4)2 5 g/l Bromothymol Blue 5 ml/l Agar 20 g/l pH 7,2 - 8 chỉnh bằng KOH 0,1M.
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Thu mẫu
- Mẫu chất thải thu trực tiếp từ cuối nguồn thải (sau biogas) của hầm ủ (hình 5A) hay túi ủ biogas (hình 5B) trại chăn ni heo.
- Cách thu: Khử trùng keo đựng, vá, tay người thu mẫu bằng cồn 70o, dùng vá lấy chất thải ở cuối nguồn thải để tráng keo, sau đó lấy chất thải khác ở cuối nguồn cho vào keo nhựa, đậy kín nắp, ghi nhãn, trữ lạnh trong thùng đá, mang về phịng thí nghiệm phân tích mẫu và bảo quản trong tủ lạnh từ 2 - 80
C (Hình 5C).
Hình 5. Thu mẫu chất thải trại chăn nuôi heo (sau biogas) (ngày 24/05/2011)
(A) Thu mẫu tại hầm ủ biogas; (B) Thu mẫu tại túi ủ biogas; (C) Thu mẫu
3.3.2. Phân tích mẫu chất thải sau biogas
* Mục đích: Nhằm đánh giá sơ bộ chất lượng của mẫu chất thải sau giai đoạn biogas và kiểm tra mức độ hiện diện của các loại vi khuẩn trong mẫu chất thải tiến hành đo pH và đếm mật số vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P.
* Đo pH: Chuẩn bị dung dịch đo pH bằng cách lắc đều mẫu chất thải, đo pH dung dịch mẫu bằng máy đo pH ở nhiệt độ phòng.
* Đếm mật số: Mật số vi khuẩn sản xuất chất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P được xác định bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Hoben và Somasegaran, 1982). Phương pháp tiến hành như sau:
- Pha loãng mẫu
+ Cho 1ml mẫu chất thải lỏng vào 99 ml nước cất vơ trùng trong bình Erlenmeyer 250 ml đã khử trùng, đậy bình bằng nút gòn và giấy dầu, lắc đều. Lúc này mẫu được pha loãng 100 lần, độ pha loãng là 10-2
.
+ Hút 1ml mẫu đã pha lỗng từ bình tam giác cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước cất đã khử trùng, mẫu gốc đã được pha loãng 1000 lần, độ pha loãng 10-3. Tương tự, pha lỗng tiếp đến 10-4
(hình 6A). - Nhỏ giọt
+ Dùng micropipet nhỏ giọt dung dịch ở mỗi độ pha loãng tương ứng 10-2, 10-3, 10-4 vào ô đã đánh dấu trên đĩa petri có các mơi trường phân lập (20μl dung dịch/1 giọt, nhỏ 3 giọt/1 ô). Nhỏ gọn, nhẹ sao cho từng giọt tỏa trịn, đều, các giọt đều nằm trong ơ và khơng dính nhau.
+ Để khô đĩa trong tủ cấy vô trùng khoảng 5 phút. Sau đó, ủ trong tủ ủ ở 30oC, ủ khoảng 24 giờ (đối với vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học), 48 giờ (vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P) tiến hành đếm mật số bằng phương pháp đếm sống (hình 6B).
- Đếm mật số: Chọn đếm vi khuẩn ở 1 độ pha lỗng có các khuẩn lạc rời và số lượng đủ lớn trong mỗi giọt, tính số khuẩn lạc trung bình. Tính mật số vi khuẩn như sau:
Số tế bào/ml =
n: số khuẩn lạc trung bình của 3 giọt đếm V: Thể tích một giọt nhỏ (20µl)
D: Độ pha lỗng
1000: hệ số quy đổi từ µl sang ml
3.3.3. Phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P khuẩn tích lũy poly-P
Từ mẫu chất thải trại heo (sau biogas), lắc đều, pha lỗng ở nồng độ thích hợp, hút 50µl trải lên đĩa petri có chứa các mơi trường phân lập, dùng que thủy tinh trải đều khắp mặt thạch, để khô trong tủ cấy khoảng 5 phút, ủ ở 300
C trong tủ ủ khoảng 24 giờ (vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học), 48 giờ (vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P).
* Tách rịng vi khuẩn
- Chọn những khuẩn lạc rời khác nhau từ đĩa môi trường trên cấy chuyển nhiều lần sang đĩa môi trường cùng loại đến khi các khuẩn lạc rời rạc, đồng nhất (hình 7A).
n
. D .1000 (cfu/ml) V
- Sau đó chuyển một khuẩn lạc rời vào ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng cùng loại để kiểm tra độ ròng bằng phương pháp giọt ép (hình 7B).
Hình 6. Pha lỗng (A) và nhỏ giọt (B) trong phương pháp đếm sống
(ngày 02/06/2011)
Hình 7. (A) Khuẩn lạc cấy chuyển từ mẫu trải, (B) Khuẩn lạc ròng được trữ trong ống
nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng (ngày 15/06/2011)
* Kiểm tra độ ròng bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần
- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn: Khử trùng lam và lamen bằng cồn, để khô. Nhỏ 25 μl nước cất vô trùng lên lam. Dùng que cấy để nguội sau khi đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn lấy một ít khuẩn lạc rời rồi trải đều lên giọt nước trên lam. Lấy lamen đậy lên giọt nước bằng cách để lamen tiếp xúc với kính mang vật và giọt nước một góc 45o, hạ kính đậy vật xuống nhẹ nhàng để tránh bị bọt khí. Quan sát và kiểm tra độ ròng của mẫu.
- Nếu mẫu ròng (xem như 1 dòng) đồng thời tiến hành quan sát hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn. Sau đó trữ mẫu đã rịng vào 2 ống nghiệm chứa môi trường trên để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Khuẩn lạc rời 102 103 104 A B A B
* Mơ tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn
Sau khi các dòng vi khuẩn đã ròng, tiến hành cấy trên môi trường cùng loại để quan sát các dạng hình thái khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt và đo kích thước khuẩn lạc bằng thước milimet (mm).
3.3.4. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P
a. Tuyển chọn vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
Mục đích: Kiểm tra hiệu quả kết tụ của các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học phân lập được nhằm xác định tỉ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, từ đó chọn ra 01 dịng vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao nhất ở mỗi loại mơi trường để giải trình tự và nhận diện vi khuẩn.
* Quy trình thực hiện
Sử dụng kaolin để kiểm tra khả năng kết tụ sinh học của những dòng vi khuẩn phân lập được.
- Nuôi cấy vi khuẩn trong ống falcon có 10ml mơi trường ni cấy vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học lỏng, nuôi lắc liên tục 4 ngày, ở 300
C (hình 8).
Hình 8. Vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học được nuôi trong ống Falcon
(ngày 18/10/2011)
- Cho vào ống nghiệm: 18ml kaolin (5g/l) + 2ml dung dịch CaCl2 (1g/l) + 20µl dung dịch vi khuẩn (mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn).
- Để yên 5 phút.
- Khả năng kết tụ sinh học của các dịng vi khuẩn được tính theo cơng thức:
Tỉ lệ kết tụ =
b. Tuyển chọn các vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Mục đích: Khảo sát khả năng oxy hóa ammonium, khử nitrate và khử nitrite của các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ. Từ đó chọn lọc ra 02 dòng phát triển tốt và ổn định ở từng mơi trường để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
Khả năng oxy hóa ammonium, khử nitrate và khử nitrite của các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ thể hiện thông qua sự phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường minimal bổ sung:
- NH4+ dưới dạng NH4Cl (vi khuẩn oxy hóa ammonium) qua các nồng độ tăng dần từ 100 – 900 mM.
- NO3- dưới dạng NaNO3 (vi khuẩn khử nitrate) qua các nồng độ tăng dần từ 100– 1000 mM.
- NO2- dưới dạng NaNO2 (vi khuẩn khử nitrite) qua các nồng độ tăng dần từ 10– 100 mM.
- Đồng thời NH4+, NO3- và NO2- (vi khuẩn T - oxy hóa ammonium, khử nitrate, khử nitrite) qua các nồng độ:
(A) NH4+ (100 mM), NO3- (100 mM), NO2- (10 mM). (B) NH4+ (200 mM), NO3- (200 mM), NO2- (20 mM). (C) NH4+ (300 mM), NO3- (300 mM), NO2- (30 mM). (D) NH4+ (400 mM), NO3- (400 mM), NO2- (40 mM).
Tiến hành cấy: Dùng que cấy hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, chạm đầu que cấy vào ống nghiệm chứa các dòng vi khuẩn đã rịng, cấy trên mơi trường minimal bổ sung NH4+, NO3-, NO2-, ủ trong tủ ủ ở 30oC, ghi nhận kết quả sau khi ủ 48 giờ.
ODđối chứng - ODmẫu
x 100%
A. Phát triển yếu B. Phát triển trung bình C. Phát triển tốt
Hình 9. Xác định khả năng phát triển của vi khuẩn (ngày 27/12/2011)
Đánh giá khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn ở các mức độ:
- Dịng khơng phát triển (-), là dịng khơng có khả năng chuyển hóa mơi trường đó.
- Dịng phát triển yếu (+), là dịng có khả năng chuyển hóa thấp (hình 9A).
- Dịng phát triển trung bình (++), là dịng có khả năng chuyển hóa trung bình (hình 9B).
- Dịng phát triển mạnh (+++) là dịng có khả năng chuyển hóa tốt (hình 9C). Trên từng môi trường, ở mỗi nồng độ chọn ra những dòng phát triển để tiếp tục khảo sát ở nồng độ cao hơn. Từ đó tìm ra được những dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ tốt và ổn định từ nồng độ thấp đến nồng độ cao ở từng môi trường.
c. Tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P
Mục đích: chọn 02 dịng vừa phát triển tốt trên mơi trường ni cấy vi khuẩn tích lũy poly-P vừa khơng hịa tan phosphate khó tan và có hàm lượng polyphosphate cao nhất để tiến hành hành thí nghiệm tiếp theo.
* Xác định khả năng phát triển của vi khuẩn trên môi trường ni cấy vi khuẩn tích lũy poly-P (Wang et al., 2008)
Xác định khả năng tích lũy poly-P trên mơi trường tích lũy poly-P có bổ sung 2% agar và quan sát trong 5 ngày. Chọn những dịng có khả năng phát triển tốt, loại bỏ những dịng khơng phát triển trong ngày đầu và dòng phát triển yếu hay trung bình (sau 05 ngày theo dõi). Khả năng phát triển mạnh hay yếu của các dịng vi khuẩn tích lũy poly-P được đánh giá tương tự vi khuẩn chuyển hóa nitơ (hình 9).
* Xác định khả năng hịa tan phosphate trên mơi trường phosphate khó tan (Nautiyal, 1999)
Để nhận diện nhanh vi khuẩn tích lũy poly-P, sử dụng mơi trường phosphate khó tan có chất chỉ thị pH Bromothymol Blue 0,5% (w/v) trong mơi trường, nếu vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P thì khơng làm giảm màu xanh của chất chỉ thị do khơng có acid hữu cơ do vi khuẩn tổng hợp tạo ra làm pH giảm, đồng thời không tạo “halo”. Tiến hành quan sát 2 lần, mỗi lần cách nhau 2 ngày, chọn ra những dịng vi khuẩn khơng phát triển trên môi trường phosphate khó tan hoặc phát triển nhưng không tạo “halo”.
Xác định khả năng tích lũy poly-P của các dòng vi khuẩn phân lập bằng cách giao kết quả của 2 lần kiểm tra trên, chọn các dòng phù hợp với 2 chỉ tiêu lựa chọn: phát triển tốt trên mơi trường tích lũy poly-P và khơng hịa tan phosphate.
* Xác định hàm lượng poly-P (Eixler et al., 2005)
Ly trích poly-P
Nuôi vi khuẩn trong chai ampicillin chứa 4 ml mơi trường tích lũy poly-P, lắc 160 vòng/phút. Sau 6 ngày ni, tiến hành ly tâm 12000 vịng/phút trong 5 phút để thu sinh khối, loại bỏ phần nước dịch. Hòa tan sinh khối trong 4 ml dung dịch NaOH 0,2N, ủ trong 20 giờ để ly trích poly-P. Dịch tế bào được lọc qua giấy lọc Sartorius Stedim 17598, 0,45 m, CE để loại bỏ xác tế bào. Thu dịch lọc chứa poly-P. Chia dịch
lọc làm 02 phần (mỗi phần 2ml):
- Phần 1 được đem đo để xác định lượng phosphate tự do (PP1) trong dung dịch bằng phương pháp Molypdate blue (so màu ở bước sóng 880nm trên máy Beckman Coulter DU 640B).
- Phần 2 được thủy phân bằng HCl 1M ở 100oC, 10 phút. Dịch thủy phân sau đó để nguội và đem đo hàm lượng phosphate (PP2) với phương pháp như phần 1.
Hàm lượng poly-P nội bào được tính bằng hiệu số giữa PP2 - PP1.
Đo poly-P bằng phương pháp Molypdate blue (so màu ở bước sóng 880nm
trên máy Beckman Coulter DU 640B)
- Dựng đường chuẩn P2O5: gồm 06 ống nghiệm (loại 20ml), đánh số thứ tự từ 0, 10, 20, 30, 40, 50 tương ứng với hàm lượng P2O5 trong ống, lần lượt thêm vào mỗi ống các thành phần ở bảng 5.
Bảng 5. Thành phần của dãy đƣờng chuẩn P2O5 Ống nghiệm Hóa chất 0 10 20 30 40 50 Nước cất (ml) 5 5 5 5 5 5 Dung dịch A (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Dung dịch B (ml) 4 4 4 4 4 4 Nước cất (ml) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 Hàm lượng P2O5/1 ống (mg/l) 0 10 20 30 40 50 Tiến hành vortex các ống nghiệm và để ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra theo nguyên tắc hàm lượng P2O5 càng cao thì màu xanh càng đậm dần (hình 10).
Hình 10. Đường chuẩn đo poly-P (ngày 16/02/2012)
- Mẫu: Chuẩn bị 2 ống nghiệm (loại 20 ml) cho mỗi mẫu (phần 1 và phần 2), cho vào mỗi ống nghiệm lần lượt các thành phần sau:
+ 5 ml nước cất. + 4 ml dung dịch B. + 3 ml nước cất.
+ 0,5 ml dung dịch mẫu
Trộn đều dung dịch trong ống nghiệm trên máy vortex, để ổn định 20 phút tại