KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân tích mẫu
Tổng số mẫu chất thải thu từ trại chăn nuôi heo (sau biogas) tại các huyện tỉnh Trà Vinh là 14 mẫu, tất cả các mẫu đều ở dạng chất lỏng. Số mẫu chất thu được từ các huyện thể hiện ở bảng 6 và nguồn gốc các mẫu được trình bày ở bảng 11 (phụ lục 1).
Bảng 6. Số mẫu chất thải thu đƣợc từ các huyện tỉnh Trà Vinh
STT Địa điểm thu mẫu Số mẫu
1 Châu Thành 2 2 Càng Long 2 3 Cầu kè 3 4 Trà cú 1 5 Cầu Ngang 3 6 Tiểu Cần 3
Kết quả đo pH các mẫu chất thải được trình bày ở hình 12.
7.67 6.19 7.93 5.88 5.61 7.06 6.82 7.14 7.04 6.24 6.6 6.45 6.92 5.62 4 5 6 7 8 9 H.1 H.2 H.3 H.4 H.5 H.6 H.7 H.8 H.9 H.10 H.11 H.12 H.13 H.14 mẫu chất thải pH
Hình 12. Kết quả đo pH các mẫu chất thải
Theo Trương Quốc Phú và Vũ Ngọc Út (2006) pH là một trong những nhân tố mơi trường có ảnh hưởng đến đời sống thủy sinh vật. pH thích hợp là 6,5 – 9, pH mơi trường nước quá cao hay quá thấp đều không thuận lợi cho quá trình phát triển của chúng. Nếu giá trị độ pH quá thấp, nước chua quá giới hạn cho phép thường có nhiều khí CO2, thiếu dưỡng khí O2, mặt khác các vi khuẩn, tảo độc có hại trong mơi trường yếm khí phát triển thuận lợi, nhiều vi sinh vật gây bệnh cũng phát triển. Môi trường
nước kiềm cao (giá trị độ pH > 9) quá ngưỡng cho phép cũng khơng thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của các loài thủy sinh vật.
Kết quả đo pH cho thấy, 14 mẫu chất thải có pH trong khoảng 5,61 – 7,93, 08 mẫu có pH nằm trong khoảng 6,5 - 9, 06 mẫu có pH dưới mức pH 6,5, điều này chứng tỏ chất lượng nước thải trại chăn nuôi heo (sau biogas) của một số mẫu chất thải thu thập ở tỉnh Trà Vinh dưới mức an tồn, có thể có nguy cơ gây hại cho thủy sinh vật.
Kết quả đếm mật số vi khuẩn được trình bày ở bảng 12 (phụ lục 1) và hình 13.
5.54 5.7 5.52 6.3 5.96 5.99 5.47 5.13 4.81 5.12 6.08 4.99 5.57 5.51 4 5 6 7 H.1 H.2 H.3 H.4 H.5 H.6 H.7 H.8 H.9 H.10 H.11 H.12 H.13 H.14 mẫu chất thải m ật s ố ( lo g cf u /m l)
Hình 13. Mật số vi khuẩn trung bình các mẫu chất thải
Thành phần vi khuẩn trong các mẫu chất thải khá đa dạng phong phú, hầu hết tất cả các mẫu chất thải đều hiện diện các loại vi khuẩn như: vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P. Mật số từng loại vi khuẩn được trình bày ở bảng 12 (phụ lục 1).
Mật số trung bình các mẫu chất thải trong khoảng từ 4,81 log10cfu/ml (H.09) - 6,30 log10cfu/ml (H.04), cụ thể từng mẫu chất thải ở hình 13.
4.2. Kết quả phân lập
Từ 14 mẫu chất thải phân lập được 188 dịng vi khuẩn, trong đó có 28 dịng vi khuẩn phân lập từ môi trường sản xuất chất kết tụ sinh học, 135 dòng vi khuẩn phân lập từ mơi trường chuyển hóa nitơ và 25 dịng vi khuẩn phân lập từ mơi trường tích lũy poly-P. Kết quả cụ thể như sau:
4.2.1. Kết quả phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
28 dịng vi khuẩn có khả năng sản xuất chất kết tụ sinh học, trong đó có 15 dịng phân lập từ môi trường sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide (chiếm 53,57%) và 13 dịng từ mơi trường sản xuất chất kết tụ sinh học protein (chiếm 46,43%). Nguồn gốc 28 dòng vi khuẩn phân lập được trình bày ở bảng 13 (phụ lục 2). Đặc điểm của khuẩn lạc và đặc điểm tế bào vi khuẩn được trình bày ở bảng 14 (phụ lục 2).
Đặc điểm của khuẩn lạc
Hầu hết các khuẩn lạc có dạng trịn, màu trắng đục hay trắng sữa, bề mặt khuẩn lạc mơ, bìa ngun, đường kính khuẩn lạc tương đối lớn sau 24 giờ nuôi cấy. Cụ thể:
- Màu sắc của khuẩn lạc: 11/28 dòng chiếm 39,29% màu trắng đục; 16/28 dịng chiếm 57,14% có màu trắng sữa và 01 dịng chiếm 3,57% có màu tím sen.
- Hình dạng khuẩn lạc: 26/28 dòng chiếm 92,86% dạng tròn và 02 dòng chiếm 7,14% dạng khơng đều.
- Dạng bìa khuẩn lạc: 27/28 dịng chiếm 96,43% dạng bìa nguyên và 01/28 dịng chiếm 3,57% dạng bìa răng cưa.
- Độ nổi khuẩn lạc: 26/28 dòng chiếm 92,86% độ nổi mô và 02 dịng chiếm 7,14% có dạng lài.
- Kích thước khuẩn lạc: Đường kính trung bình khuẩn lạc khoảng 1,4 – 5 mm, cụ thể: 13 dịng chiếm 46,43% có đường kính nhỏ hơn 2 mm, 15 dịng chiếm 53,57% có đường kính lớn hơn 2 mm.
Đặc điểm của tế bào vi khuẩn
- Hình dạng tế bào vi khuẩn: Hầu hết các dịng vi khuẩn có dạng que ngắn 22/28 dòng chiếm 78,57%; một số dạng que dài 06/28 dòng chiếm 21,43%.
- Khả năng chuyển động: Đa số có khả năng chuyển động 20/28 dòng chiếm 71,43%; một số khơng chuyển động 08/28 dịng chiếm tỉ lệ 28,57%.
Đặc điểm một số khuẩn lạc vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học được trình bày ở hình 14.
Hình 14. Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
(ngày 25/07/2012)
A: Dòng 05.PS.3 khuẩn lạc trịn, màu tím sen, ngun, mơ B: Dịng 04.P.1 khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, ngun, mơ C: Dịng 12.P.1 khuẩn lạc trịn, màu trắng sữa, ngun, mơ D: Dòng 08.PS.1 khuẩn lạc trịn, màu trắng sữa, ngun, mơ
Chụp dưới kính hiển vi điện tử quét JSM 5500 cho thấy dịng 03.PS.3 có dạng hình que ngắn (hình 15).
Hình 15. Hình dạng dịng vi khuẩn 03.PS.3 chụp dưới kính hiển vi điện tử qt ở độ
phóng đại 12000 lần (ngày 15/05/2012)
A B
4.2.2. Kết quả phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Trong 135 dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ có 33 dịng chiếm 24,4% phân lập trên môi trường ammonium, 31 dịng chiếm 23% phân lập trên mơi trường nitrate, 31 dòng chiếm 23% phân lập trên mơi trường nitrite và 40 dịng chiếm 29,6% phân lập trên môi trường T (ammonium, nitrate và nitrite).
Nguồn gốc các dịng vi khuẩn được trình bày ở bảng 15 (phụ lục 2). Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào vi khuẩn được mô tả ở bảng 7 và bảng 16 (phụ lục 2).
Đặc điểm của khuẩn lạc
Thời gian trung bình để các dịng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường minimal là 48 giờ.
- Màu sắc khuẩn lạc: Đa số khuẩn lạc màu trắng đục 76 dòng chiếm 56,30% hay trắng sữa 32 dịng chiếm 23,70%; ngồi ra cịn có dạng màu vàng nhạt 06 dòng chiếm 4,44%; nâu nhạt 08 dòng chiếm 5,93%; trắng ngã vàng 09 dòng chiếm 6,67%; hồng nhạt 01 dòng chiếm 0,74%; cam nhạt 02 dịng chiếm 1,48%.
- Hình dạng khuẩn lạc: hầu hết có dạng tròn 133 dòng chiếm 98,52%, chỉ có 02 dịng dạng khơng đều chiếm 1,48%.
- Độ nổi: phần lớn có độ nổi mơ 116 dòng chiếm 85,93%, một số độ nổi lài 17 dòng chiếm 12,59% và cầu chồng 02 dòng chiếm 1,48%.
- Dạng bìa: đa số có dạng bìa ngun 127 dịng chiếm 94,07%, một số có dạng bìa răng cưa 8 dịng chiếm 5,93%.
- Kích thước khuẩn lạc: đường kính khuẩn lạc trung bình khoảng 0,5- 4,0 mm, cụ thể: 88/135 dịng chiếm 65,19% có kích thước khuẩn lạc nhỏ hơn 1,0 mm, 45/135 dòng chiếm 33,33% có kích thước khuẩn lạc lớn hơn 1,0 mm nhưng nhỏ hơn 2,0 mm, 02/135 dịng chiếm 1,48% có kích thước khuẩn lạc lớn hơn 2,0 mm.
Bảng 7. Tổng kết đặc điểm của khuẩn lạc vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Đặc điểm
khuẩn lạc Các loại
Vi khuẩn phân lập trên môi trƣờng
ammonium Nitrate nitrite T
Hình dạng Trịn 32 31 30 40 Không đều 01 01 Màu sắc Trắng đục 25 17 12 22 Trắng sữa 02 10 14 6 Vàng nhạt 03 03 Nâu nhạt 01 02 03 02 Trắng ngã vàng 01 02 06 Hồng nhạt 01 Cam nhạt 02 Dạng bìa Nguyên 32 31 31 34 Răng cưa 01 01 06 Độ nổi Mô 32 30 29 25 Lài 01 01 02 13 Cầu chồng 02 Đường kính 1mm 22 26 19 21 >1 và 2 mm 11 5 12 17 > 2mm 2
Đặc điểm của tế bào vi khuẩn
Đa số có dạng que ngắn và chuyển động. Cụ thể về hình dạng và khả năng chuyển động của các loại vi khuẩn thể hiện ở bảng 16 (phụ lục 2) và bảng 8.
- Hình dạng tế bào vi khuẩn: Dạng que ngắn 131 dòng chiếm 97,04%; dạng que dài 01 dòng chiếm 0,74%; dạng chùm 02 dòng chiếm 1,48%; dạng sợi 01 dòng chiếm 0,74%.
- Khả năng chuyển động: 132 dòng chiếm 97,78% có khả năng chuyển động và 03 dịng chiếm 2,22% khơng chuyển động.
Bảng 8. Tổng kết đặc điểm của tế bào vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Đặc điểm vi
khuẩn Các loại
Vi khuẩn phân lập trên môi trƣờng
ammonium nitrate Nitrite T
Hình dạng Que ngắn 31 31 31 38 Que dài 01 Sợi 01 Chùm 02 Khả năng chuyển động + 32 31 31 38 - 01 02
(+): chuyển động; (-): không chuyển động
Đặc điểm của khuẩn lạc một số loại vi khuẩn chuyển hóa nitơ được trình bày ở hình 16.
Hình 16. Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn chuyển hóa nitơ (ngày 26/09/2011)
2.T.4 6.O2.1 7T1 14.O3.4
4.T.5 6.T.1 7.T.3
11.T.3 12.T.2 12.T.4 5.H4.4
Chụp dưới kính hiển vi điện tử quét JSM 5500 cho thấy dịng 03.T.1 có dạng hình que ngắn (hình 17).
Hình 17. Hình dạng dịng vi khuẩn 03.T1 chụp dưới kính hiển vi điện tủ ở độ phóng
đại 5500 lần (ngày 15/05/2012) 4.2.3. Kết quả phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P
Từ 14 mẫu chất thải phân lập được 25 dịng vi khuẩn tích lũy poly-P, thời gian trung bình để các dịng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường tích lũy poly-P khoảng 48 giờ. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn được trình bày ở bảng 17 (phụ lục 2). Đặc điểm của tế bào vi khuẩn và đặc điểm của khuẩn lạc được mô tả ở bảng 18 (phụ lục 2).
Đặc điểm của khuẩn lạc
- Hình dạng khuẩn lạc: Hầu hết có dạng trịn 24/25 dịng chiếm 96,0%, có 01 dịng chiếm 4,0% có dạng khơng đều.
- Màu sắc khuẩn lạc: Có 16/25 dòng chiếm 64,0% màu trắng đục, 03/25 dòng chiếm 12,0% màu trắng sữa, 03/25 dòng chiếm 12,0% màu trắng trong, 01/25 dòng chiếm 4,0% màu hồng nhạt, 02/25 dòng chiếm 8,0% màu vàng nhạt.
- Dạng bìa khuẩn lạc: Đa số có dạng bìa ngun 22/25 dịng chiếm 88,0%, một vài dịng có dạng bìa răng cưa 03/25 dịng chiếm 12,0%,
- Độ nổi khuẩn lạc: Khuẩn lạc có độ nổi mơ 18/25 dịng chiếm 72,0%, khuẩn lạc độ nổi lài 06/25 dòng chiếm 24,0%, ngồi ra cịn có dạng cầu chồng 01/25 dịng chiếm 4,0%.
- Đường kính khuẩn lạc: kích thước khuẩn lạc trung bình khoảng 0,5 - 3,0mm, có 11/25 dịng chiếm 44,0% khuẩn lạc có kích thước nhỏ hơn 1,0 mm, 10/25 dịng chiếm
40,0% kích thước khuẩn lạc lớn hơn 1,0 mm nhưng nhỏ hơn 2,0 mm; 04/25 dịng chiếm 16,0% khuẩn lạc kích thước lớn hơn 2,0 mm.
Một số dạng khuẩn lạc của các dịng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập được thể hiện ở hình 18.
Hình 18. Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn tích lũy poly-P (ngày 15/12/2011)
Đặc điểm của tế bào vi khuẩn
- Hình dạng tế bào vi khuẩn: Đa số có dạng que ngắn 23/25 dòng chiếm 92,0%, ngồi ra cịn có dạng que dài 02/25 dòng chiếm 8,0%.
- Khả năng chuyển động: Hầu hết các dòng chuyển động được 23/25 dòng chiếm 92,0%, khơng chuyển động là 02/25 dịng chiếm 8,0%.
Chụp dưới kính hiển vi điện tử quét JSM 5500 cho thấy dịng 01.L.1 có dạng hình que dài (hình 19).
Hình 19. Hình dạng dịng vi khuẩn 05.L.4 chụp dưới kính hiển vi điện tử ở độ phóng
đại 12000 lần (ngày 15/05/2012) 1.L.1 9.L.1 12.L.2 5.L.4 13.L.3 13.L.2
4.3. Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P
4.3.1. Kết quả tuyển chọn vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
Kết quả kiểm tra khả năng kết tụ của các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học được trình bày ở bảng 19 (phụ lục 3).
Tỉ lệ kết tụ của 28 dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học như sau: có 01 dịng có tỉ lệ kết tụ trên 50% chiếm 3,57%; 02 dịng có tỉ lệ kết tụ từ 40 đến 50% chiếm 7,14%; 08 dịng có tỉ lệ kết tụ từ 30 đến 40% chiếm 28,57%; 08 dịng có tỉ lệ kết tụ từ 20 đến 30% chiếm 28,57%; 09 dịng có tỉ lệ kết tụ từ 10 đến 20% chiếm 32,14%.
Chọn 02 dịng có tỉ lệ kết tụ cao nhất là 03.PS.3 (tỉ lệ kết tụ là 44,09%) và 04.P.1 (tỉ lệ kết tụ là 50,87%) để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
4.3.2. Kết quả tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Kết quả khảo sát khả năng phát triển của các dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ trên mơi trường minimal có bổ sung NH4+
, NO3-, NO2- qua các nồng độ tăng dần trình bày ở bảng 20 (phụ lục 3). Kết quả cho thấy, đa số các dịng phát triển trên mơi trường này, chứng tỏ các dịng có khả năng chuyển hóa nitơ, tuy nhiên khả năng chuyển hóa của các dòng giảm khi nồng độ tăng dần. Cụ thể như sau:
Vi khuẩn oxy hóa ammonium
Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn oxy hóa ammonium trên mơi trường minimal bổ sung NH4+ trình bày ở hình 20.
33 33 31 29 26 17 15 12 0 0 10 20 30 40 100 200 300 400 500 600 700 800 900 nồng độ ammonium (mM) số dị ng ph át tr iể n
Hình 20. Số dịng vi khuẩn oxy hóa ammonium phát triển trên mơi trường minimal bổ sung NH4+
Ở nồng độ 100 – 400 mM thì đa số các dịng đều phát triển, chỉ một vài dịng khơng phát triển. Chứng tỏ các dòng này có khả năng oxy hóa ammonium ở nồng độ
từ 100 – 400mM. Các dòng phát triển tiếp tục được khảo sát ở nồng độ từ 500 - 900 mM, kết quả khả năng phát triển của các dòng này vẫn mạnh nhưng giảm dần khi nồng độ NH4+
tăng dần.
Ở nồng độ 800mM, khả năng phát triển của các dịng vi khuẩn giảm rõ rệt. Có 12 dịng chiếm 36,36% phát triển, trong đó có 03 dịng chiếm 9,09% phát triển mạnh (12.H4.1, 12.H4.2, 14.H4.4).
Ở nồng độ 900 mM, hầu hết 33/33 dịng đều khơng phát triển, cho thấy các dịng vi khuẩn khơng có khả năng oxy hóa ammonium ở nồng độ này.
Vi khuẩn khử nitrate
Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn khử nitrate trên môi trường minimal bổ sung NO3-
trình bày ở hình 21.
Ở nồng độ 100 – 500 mM, đa số các dòng đều phát triển, chỉ một vài dịng khơng phát triển, điều này cho thấy các dịng có khả năng khử nitrate ở nồng độ này.
31 31 31 30 29 26 20 18 9 0 0 10 20 30 40 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 nồng độ nitrate (mM) số dị ng ph át tr iể n
Hình 21. Số dịng vi khuẩn khử nitrate phát triển trên mơi trường minimal bổ sung
NO3-
Các dịng phát triển được khảo sát tiếp ở nồng độ từ 600 – 1000 mM. Kết quả cho thấy khả năng phát triển của các dòng này vẫn mạnh nhưng giảm dần khi nồng độ NO3- tăng dần.
Ở nồng độ 900 mM thì khả năng phát triển của các dịng vi khuẩn giảm rõ rệt. Có 9 dịng chiếm 29,03% phát triển, trong đó có 04 dịng chiếm 12,9% phát triển mạnh (03.O3.2, 06.O3.1, 12.O3.3, 14.O3.1).
Ở nồng độ 1000mM, cả 31 dịng đều khơng phát triển khơng có khả năng khử
Vi khuẩn khử nitrite
Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn khử nitrite trên môi trường minimal bổ sung NO2-
trình bày ở hình 22.
Ở nồng độ 10 – 50 mM, đa số các dòng đều phát triển, chỉ một vài dịng khơng phát triển, chứng tỏ dịng này có khả năng khử nitrite. Khả năng khử nitrite của các dòng vi khuẩn vẫn mạnh nhưng giảm dần khi nồng độ tăng dần từ 60 – 100 mM.