CHƢƠNG III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.5. Nhận diện (identification) và phân tích đa dạng di truyền các dòng
sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P
a. Ly trích DNA vi khuẩn (Breugelmans và Uyttebroek, 2004)
- Ni 12 dịng vi khuẩn đã rịng trong 5ml mơi trường LB qua đêm.
- Chuyển 4ml dịch vi khuẩn sang 2 tuýp 2ml, ly tâm 13000 vòng trong 5 phút để thu sinh khối, loại bỏ phần nước.
- Hòa tan sinh khối của 2 tuýp trong 250µl dung dịch TE pH= 8. - Thêm vào 50 µl SDS 10%.
- Tiếp theo thêm 10µl proteinase K 10mg/ml.
- Đem ủ ở 650 C trong 20 phút, 5 phút đảo ngược tuýp 1 lần.
- Thêm vào 400µl CTAB 10% 0,7M NaCl, ủ ở 650C trong 20 phút.
- Thêm 600µl Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), lắc mạnh (quá trình này thực hiện trong tủ hút), ly tâm 12000 vòng trong 10 phút.
- Chuyển phần dịch trong phía trên (500µl) sang tp 1,5ml (thao tác cẩn thận tránh làm vỡ màng ngăn).
- Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Loại bỏ phần nước
- Rửa DNA được với 1ml ethanol 70% (2 lần), mỗi lần rửa sẽ đem ly tâm 12000 vòng trong 5 phút.
- Đem sấy chân không 450C khoảng 15 phút.
- Hoà tan trong 30µl bi nước, trữ trong tủ lạnh ở -200C để chuẩn bị thực hiện phản ứng PCR.
b. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA
Sau khi trích ly DNA, các dịng vi khuẩn sẽ tiến hành phản ứng PCR bằng máy PCR Perkin Elmer PE 9700 khuếch đại đoạn 16S rDNA để nhận diện một số dòng vi khuẩn với các cặp mồi chuyên biệt cho từng loại vi khuẩn.
* Vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
Để nhận diện vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, sử dụng cặp mồi 37F và 1479R khuếch đại trình tự 16S-rDNA được thiết kế (theo Jie et al,. 2006) với trình tự:
Mồi xi 37F 5’ – AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG – 3’ Mồi ngược 1479R 5’ – ACGGCAACCTTGTTACGAGTT – 3’ - Một phản ứng PCR có thể tích 50µl, gồm các thành phần sau: BiH2O 24 µl Buffer NH4+ 5 µl dNTP 8 µl MgCl2 4 µl Mồi xi 37F 2 µl Mồi ngược 1479R 2 µl BSA 0,5 µl Taq polymerase 0,5 µl DNA 4 µl
- Các giai đoạn phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn: + Giai đoạn biến tính ở nhiệt độ 950
C trong 6 phút + Giai đoạn nhân bản: 35 chu kỳ (biến tính: 950
C trong 1 phút 30 giây; bắt cặp: 570C trong 1 phút; kéo dài: 720C trong 1 phút 30 giây)
* Vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Để nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ, sử dụng cặp mồi 8F và 1492R khuếch đại trình tự 16S-rDNA được thiết kế (theo Turner et al., 1999) với trình tự sau:
Mồi xuôi 8F 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’ Mồi ngược 1492R 5’-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’ - Một phản ứng PCR có thể tích 50 µl, gồm các thành phần sau: BiH2O 24 µl Buffer NH4+ 5µl dNTP 8 µl MgCl2 4 µl Mồi xi 8F 2 µl Mồi ngược 1492R 2 µl BSA 0,5 µl Taq polymerase 0,5 µl DNA 4 µl
- Các giai đoạn phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn: + Giai đoạn biến tính ở nhiệt độ 950
C trong 5 phút + Giai đoạn nhân bản: 30 chu kỳ (biến tính: 950
C trong 30 giây; bắt cặp: 550C trong 30 giây; kéo dài: 720C trong 1 phút 30 giây)
+ Giai đoạn hoàn tất ở 720
C trong 10 phút, 10oC trong .
* Vi khuẩn tích lũy poly-P
Để nhận diện vi khuẩn tích lũy poly-P, sử dụng cặp mồi 27F và 1492R khuếch đại trình tự 16S-rDNA được thiết kế (theo Kim et al., 2010) với trình tự sau:
Mồi xi 27F 3’ –AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG- 5’ (M là A hoặc T) Mồi ngược 1492R 3’ –ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT- 5’
- Một phản ứng PCR có thể tích 50 µl, gồm các thành phần sau: BiH2O 24 µl Buffer NH4+ 5 µl dNTP 8 µl MgCl2 4 µl Mồi xi 27F 2 µl Mồi ngược 1492R 2 µl BSA 0,5 µl Taq polymerase 0,5 µl DNA 4 µl
- Các giai đoạn phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn: + Giai đoạn biến tính ở nhiệt độ 950
C trong 5 phút. + Giai đoạn nhân bản: 30 chu kỳ (biến tính: 950
C trong 1 phút; bắt cặp: 570C trong 45 giây; kéo dài: 720C trong 1 phút 30 giây).
+ Giai đoạn hoàn tất ở 720C trong 7 phút, 10oC trong .
c. Điện di trên gel agarose để phát hiện sản phẩm PCR
Các sản phẩm sau khi đã khuếch đại bằng phản ứng PCR sẽ tiếp tục được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,2 % có bổ sung ethidium bromide (EtBr 0,5 mg/l). Nhằm so sánh kích thước DNA của sản phẩm PCR với thang DNA chuẩn và kiểm tra độ tinh sạch của DNA. Qui trình thực hiện như sau:
* Chuẩn bị gel: Cân 0,48g agarose cho vào bình tam giác đựng 40ml dung dịch TAE 1X, dùng lị vi sóng đun hỗn hợp trong 3 phút cho agarose tan hoàn toàn. Lấy ra để nguội khoảng 10 phút, bổ sung 800µl ethidium bromide và lắc nhẹ cho đều. Sau đó đổ nhẹ dung dịch agarose vào khn để định hình gel (khi đổ gel phải đổ dứt khốt để tránh bọt khí làm ảnh hưởng đến sự điện di sản phẩm PCR).
* Điện di: Đặt agarose gel đã được định hình vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE 1X, load 10µl mẫu sản phẩm PCR của DNA đã được trộn với 2µl loading buffer vào giếng trên gel agarose. Tiến hành điện di trên gel ở hiệu điện thế 95 volt trong 45 phút.
* Quan sát các băng (band) DNA trên gel bằng hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 để nhận diện các dòng vi khuẩn bằng cách quan sát các băng xuất hiện trên gel, so sánh kích thước DNA của sản phẩm PCR với thang DNA chuẩn.
d. Giải trình tự DNA các dịng vi khuẩn
- Mẫu sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng kỹ thuật điện di được gởi giải trình tự bằng mồi xuôi (mồi tiến hành PCR cho từng loại vi khuẩn) tại Công ty Macrogen ở Hàn Quốc.
- Trình tự 16S rDNA của các dòng vi khuẩn được so sánh với các trình tự 16S rDNA trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm BLAST N để xác định mức độ tương đồng của các dịng vi khuẩn đó với các dịng vi khuẩn trong ngân hàng gen. Các bước thực hiện:
+ Vào trang web của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). + Chọn BLAST/nucleotide blast/
+ Upload file trình tự 16S của từng dòng vi khuẩn. Chọn BLAST. + Ghi nhận kết quả.
e. Xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm MEGA 5.0
- Tạo file chứa các trình tự vi khuẩn phân lập và vi khuẩn được chọn ở bước BLAST bằng công cụ Notepad với chấm đuôi txt.
- Định dạng fasta với phần mềm BioEdit - Mở file fasta bằng phần mềm MEGA 5.05 - Tiến hành Alignment (Align by ClustalW)
- Click Data/ phylogenetic analysis. Click phylogeny (vẽ cây phả hệ) - Chọn Construct/ Test neighbor joining tree
- Chọn Boostrap method và 1000 lần lặp lại.
- Click Compute, chờ xuất hiện cây phả hệ và sử dụng chỉ số boostrap để đánh giá cây phả hệ.
Q trình tiến hành thí nghiệm có thể được tóm tắt như sau (hình 11): Thu mẫu chất thải từ trại heo (sau biogas)
Đo pH mẫu chất thải
Pha lỗng, nhỏ giọt mẫu nước thải trên các mơi trường
Phân lập, làm thuần, quan sát hình dạng vi khuẩn, mô tả đặc điểm khuẩn lạc
Khảo sát hoạt tính của các dịng vi khuẩn phân lập được
Giải trình tự và nhận diện vi khuẩn
Phân tích sự đa dạng di truyền vi khuẩn