CHƢƠNG III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.3. Phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển
đếm sống (hình 6B).
- Đếm mật số: Chọn đếm vi khuẩn ở 1 độ pha lỗng có các khuẩn lạc rời và số lượng đủ lớn trong mỗi giọt, tính số khuẩn lạc trung bình. Tính mật số vi khuẩn như sau:
Số tế bào/ml =
n: số khuẩn lạc trung bình của 3 giọt đếm V: Thể tích một giọt nhỏ (20µl)
D: Độ pha lỗng
1000: hệ số quy đổi từ µl sang ml
3.3.3. Phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P khuẩn tích lũy poly-P
Từ mẫu chất thải trại heo (sau biogas), lắc đều, pha lỗng ở nồng độ thích hợp, hút 50µl trải lên đĩa petri có chứa các môi trường phân lập, dùng que thủy tinh trải đều khắp mặt thạch, để khô trong tủ cấy khoảng 5 phút, ủ ở 300
C trong tủ ủ khoảng 24 giờ (vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học), 48 giờ (vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P).
* Tách ròng vi khuẩn
- Chọn những khuẩn lạc rời khác nhau từ đĩa môi trường trên cấy chuyển nhiều lần sang đĩa môi trường cùng loại đến khi các khuẩn lạc rời rạc, đồng nhất (hình 7A).
n
. D .1000 (cfu/ml) V
- Sau đó chuyển một khuẩn lạc rời vào ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng cùng loại để kiểm tra độ ròng bằng phương pháp giọt ép (hình 7B).
Hình 6. Pha lỗng (A) và nhỏ giọt (B) trong phương pháp đếm sống
(ngày 02/06/2011)
Hình 7. (A) Khuẩn lạc cấy chuyển từ mẫu trải, (B) Khuẩn lạc ròng được trữ trong ống
nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng (ngày 15/06/2011)
* Kiểm tra độ ròng bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần
- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn: Khử trùng lam và lamen bằng cồn, để khô. Nhỏ 25 μl nước cất vô trùng lên lam. Dùng que cấy để nguội sau khi đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn lấy một ít khuẩn lạc rời rồi trải đều lên giọt nước trên lam. Lấy lamen đậy lên giọt nước bằng cách để lamen tiếp xúc với kính mang vật và giọt nước một góc 45o, hạ kính đậy vật xuống nhẹ nhàng để tránh bị bọt khí. Quan sát và kiểm tra độ ròng của mẫu.
- Nếu mẫu ròng (xem như 1 dòng) đồng thời tiến hành quan sát hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn. Sau đó trữ mẫu đã rịng vào 2 ống nghiệm chứa mơi trường trên để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Khuẩn lạc rời 102 103 104 A B A B
* Mơ tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn
Sau khi các dòng vi khuẩn đã ròng, tiến hành cấy trên môi trường cùng loại để quan sát các dạng hình thái khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt và đo kích thước khuẩn lạc bằng thước milimet (mm).