CHƢƠNG II LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.5. Phƣơng pháp nhận diện vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử
2.5.1. Sơ lược về đặc điểm gen 16S rDNA
Ribosome có vai trị như là các vị trí tổng hợp protein trong các tế bào chân hạch và sơ hạch. RNA ribosome có thể chia thành nhiều loại theo kích thước của các đơn vị RNA. Hầu hết các sinh vật sơ hạch có ba rDNAs, mã hóa rRNA 5S, 16S và 23S (Lodish et al., 2004).
Gen rDNA là gen được bảo tồn nhất trong tất cả các tế bào. Các phần của chuỗi rDNA từ sinh vật có quan hệ xa thì tương đối rõ rệt. Điều này có nghĩa là trình tự từ sinh vật có quan hệ xa có thể được xếp hàng chính xác, tạo sự khác biệt chính xác thật sự dễ dàng đo lường. Vì thế, các gen mã hóa rRNA (rDNA) đã được sử dụng rộng rãi để định hướng sự phân loại, sự phát sinh giống loài, và để ước lượng tỉ lệ của sự khác nhau giữa các loài vi khuẩn. Như vậy, so sánh các chuỗi 16S rDNA cho thấy mối quan hệ tiến hóa giữa các vi sinh vật. Cơng trình này đã được thực hiện đầu tiên bởi Carl Woese, người đã đề xuất hệ thống ba lãnh giới (three Domain system) Archaea, Bacteria và Eucarya dựa trên thơng tin trình tự như vậy.
Ở vi khuẩn các gen 16S, 23S và 5S rDNA được tổ chức đặc trưng như một operon đồng sao chép. Các gen 5S đã được nghiên cứu, nhưng nó quá nhỏ (120 nucleotide) để suy luận sự phát sinh lồi chính xác. Các gen 16S rDNA (1500 nucleotide) và 23S (2900 nucleotide) đủ lớn để sử dụng cho mục đích phân loại.
(http:/www.biquest.org/bedrock/washingtondc_03_07/projectfiles/16s%20rDNAhandout.pdf)
2.5.2. Kỹ thuật PCR (Khuất Hữu Thanh, 2006)
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ enzyme polymerase) là kỹ thuật khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào, chỉ với sự hiện diện của một cặp mồi (primers pair) chuyên biệt, enzyme DNA polymerase, các nucleotide tự do, dung dịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt.
Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bước sau
- Giai đoạn biến tính (Denaturation): Các liên kết hydro trong phân tử DNA đứt ra, hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác dụng của nhiệt độ cao, thường là 90 - 950 C trong 60 đến 120 giây.
- Giai đoạn gắn đoạn mồi (Annealing): ở nhiệt độ 55 - 650 C, các đoạn mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên lý Chargaff. Giai đoạn này kéo dài từ 30 - 60 giây.
- Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (Elongation): Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotide vào cuối đoạn mồi, các đoạn mồi được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lý Chargaff, tạo nên mạch đơn mới DNA, giai đoạn này còn gọi là giai đoạn polymerase hóa (polymerization), được thực hiện ở nhiệt độ 70 - 720
C và kéo dài từ 30 giây đến vài phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA.
Các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo. Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ số lượng bản sao là 2n
2.5.3. Điện di gel agarose (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2002)
Sản phẩm phản ứng PCR được phát hiện bằng điện di trên gel agarose và quan sát kết quả dưới tia UV (bước sóng 260 nm).
Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các acid nucleic, đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường.
Agarose là loại gel thông dụng nhất, một polysaccharide được sản xuất từ tảo biển thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5 - 20kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002). Nồng độ agarose trong dung dịch đệm thường là 0,6 - 2,5%. Ngồi ra cịn có gel polyacrylamide dùng để phân tách các đoạn có kích thước dưới 1000 cặp base. Dung dịch đệm thường dùng là TAE (Tris acetate EDTA), TE (Tris EDTA), TBE (Tris boric EDTA).
Trong điện trường, DNA di chuyển từ cực âm sang điện cực dương. Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ xát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực cản ngăn sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh, do đó DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy người ta phân loại được các đoạn phân tử DNA trên gel agarose (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
Các acid nucleic trong gel agarose sẽ quan sát dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một hoá chất ethidium bromide (C21H20BrN3) là thuốc nhuộm acid nucleic do chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của acid nucleic và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Trong thao tác, ethidium bromide được cho vào gel trước khi đổ gel hay sau điện di, gel được chiếu sáng bằng tia tử ngoại, acid nucleic sẽ hiện hình dưới dạng những vạch màu đỏ cam.
Thang DNA (DNA ladder): “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker-MWM), dùng để ước lượng kích thước các trình tự acid nucleic trong gel agarose, đó là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết.
2.5.4. Phương pháp giải trình tự DNA (Khuất Hữu Thanh, 2006)
a. Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học
Phương pháp này dựa trên cơ sở biến tính phân tử DNA thành các mạch đơn không tự xoắn lại với nhau, đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 đầu 5’ của mạch đơn tạo các đoạn đánh dấu có thể được phát hiện bằng phóng xạ. Xử lý hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotid được phát hiện bằng điện di. Kết quả các phản ứng hóa học xử lí mạch DNA được phát hiện bằng điện di trên gel polyacrylamid, có thể xác định trình tự các mạch đơn.
Mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ có thể xử lí theo bốn nhóm phản ứng:
- Nhóm I: xử lý mạch đơn DNA bằng dimethyl sunfat làm đứt mạch đơn tại G. - Nhóm II: xử lý mạch đơn DNA bằng acid pH=2 gây đứt mạch đơn tại A hay G. - Nhóm III: xử lý mạch đơn DNA bằng hydrazin gây đứt mạch đơn tại C và T. - Nhóm IV: xử lý mạch đơn DNA bằng hydrazin với nồng độ muối cao làm mạch đơn bị đứt C.
Kết quả các phản ứng tạo thành các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên, có kích thước khác nhau. Điện di kết quả được trên gel polyacrylamid, đọc kết quả điện di bằng phóng xạ tự ghi, thu được trình tự của các nucleotid của mạch đơn DNA.
b. Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy
Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotid vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’ OH, khi gặp nucleotid khơng có nhóm 3’ OH phản ứng tổng hợp bị dừng lại một cách ngẫu nhiên.
Phương pháp dideoxy gồm bốn loại phản ứng, mỗi loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ có DNA khn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP có một loại được đánh dấu phóng xạ S35
hoặc P32, enzyme Taq polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện thích hợp đồng thời có thêm khoảng 1% một loại dideoxy-nucleotid ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP). Các dideoxy-nucleotid mất hai nguyên tử oxy ở C3 và C2. Khi mạch đơn DNA đang tổng hợp được gắn một ddNTP phản ứng tổng hợp ngừng lại, khơng có nhóm 3’ OH ở nucleotid cuối cùng do đó mạch đang tổng hợp không được tiếp tục kéo dài. Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn oligonucleotid dài ngắn khác nhau một nucleotid, có thể nhận biết nhờ phương pháp điện di trên gel polyacrylamid.
Các đoạn oligonucleotid kích thước khác nhau tạo nên các vị trí khác nhau trên bản gel, thực hiện phản ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát được các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch trên bản gel. Tổng hợp kết quả phản ứng ở bốn ống thu được trình tự các nucleotid của mạch đơn, có thể biết trình tự sắp xếp các nucleotid trong gen.
c. Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động
Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động dựa trên cơ sở phương pháp dideoxy. Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giải các nhầm lẫn do kỹ thuật. Có hai loại mồi xuôi (primer forward) và mồi ngược (primer reverse) được sử dụng cho mỗi mạch đơn DNA. Tiến hành biến tính DNA trong mơi trường có urea và nhiệt độ cao (khoảng 550C), hai mạch đơn DNA tách rời nhau không bắt cặp lại với nhau. Chùm tia laser đánh dấu vị trí và thời gian đi qua các nucleotid, từ đó tổng hợp được trình tự sắp xếp của gen.
2.5.5. Phần mềm phân tích DNA được giải mã
BLAST (The Basic Local Alignment Search Tool) là một chương trình được sử dụng rộng rãi nhất trong tin sinh học. BLAST dựa trên nền tảng thống kê vững chắc cho phép so sánh, tìm kiếm, giải mã 1 trình tự (DNA và protein) với tất cả các trình tự có trong ngân hàng gen (Genbank). Nói cách khác BLAST sẽ cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm DNA, protein, xác định đoạn mà ta quan tâm có tương đồng với đoạn nào trong ngân hàng gen hay không khi được cung cấp một thư viện hay cơ sở dữ liệu các chuỗi đó. Để chạy BLAST cần đầu vào là 2 chuỗi: 1 chuỗi đích và 1 chuỗi cơ sở dữ liệu. Chuỗi đích nhỏ hơn rất nhiều so với cơ sở dữ liệu.
Có 5 chương trình BLAST: BLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLAST N, TBLAST X. Trong đó BLAST N (Nucleotide – Nucleotide BLAST) cho phép so sánh chuỗi nucleotide trong ngân hàng dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information). (Kent, 2002; Ye và Madden, 2006).
2.5.6. Xây dựng cây phát sinh lồi từ trình tự DNA bằng phần mềm MEGA
Phần mềm MEGA (Molecular Evolutionary Gentics Analysis) là phần mềm ứng dụng được thiết kế để phân tích so sánh các chuỗi gen tương đồng từ các họ đa gen hoặc từ các loài khác nhau với một tầm quan trọng đặc biệt về các mối quan hệ tiến hóa của các mẫu DNA và protein. MEGA làm nổi bật sự phân tích của các trình tự thu đươc với sự phân tích tiến hóa. (Kumar et al., 2006, Tamura et al., 2011).