Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện hoạt động
10X Buffer Tango 2 20 µl hỗn hợp ủ 370C qua đêm
ADN 5 BglII 1 AccI 1 H2O 11 Thêm: FastDigest EcoRI 1 25 µl hỗn hợp ủ 370 C - 10 phút. Bất hoạt ở 800 C -20 phút 10X FastDigest Buffer 0.5 H2O 3.5 1 2 1 2
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
41
3.2.3. Sàng lọc khuẩn lạc mang vector cải biến pSFV-M7, pSFV-M8
Hỗn hợp sau phản ứng nối được biến nạp trực tiếp vào dòng vi khuẩn
E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Kết quả trên môi trường chọn lọc bổ
sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml, chúng tơi thu được hàng trăm khuẩn lạc. Từ tập hợp này, chúng tôi thu ngẫu nhiên 74 khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn ADN vector cải tiến pSFV-M7 và 65 khuẩn lạc lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn vector cải tiến pSFV-M8 bằng phản ứng colony PCR dùng cặp mồi 807/809. Đây là 2 cặp mồi nhân lên đoạn ADN chứa vùng cải tiến gồm có FLAG-tag, His-tag, vị trí Thrombin và vùng nhân dịng đa điểm của 2 vector cải tiến, có kích thước 634 bp. Thành phần và điều kiện của phản ứng colony PCR được trình bày trên bảng 14.
Bảng 14. Thành phần và điều kiện phản ứng colony PCR sàng lọc khuẩn lạc
chứa vector cải tiến pSFV-M7, pSFV-M8
Thành phần Thể tích (µl) Chu trình nhiệt
H2O 9.7 Thời gian biến tính đầu tiên:
940C, 15 phút Lặp lại 30 chu kì: + Biến tính: 940 C, 30 giây + Gắn mồi: 600 C, 30 giây + Tổng hợp: 720 C, 60 giây
Thời gian tổng hợp sau cùng:
720C, 6 phút
10X Taq pol Buffer 1.5
MgCl2 25 mM 0.3
dNTP 2mM 1.0
807/ 809 2 µM 0.5
Taq pol 1 u/µl 0.5
Khn 1.0
Tổng 15.0
(a) (b)
Hình 18. Ảnh điện di sản phẩm colony PCR sàng lọc khuẩn lạc mang vùng pSFV cải biến. (a) Làn 1-6: sàng lọc khuẩn lạc mang vector pSFV-M7; làn M: thang chuẩn 100bp; làn 7-12: sàng lọc khuẩn lạc mang vector pSFV-M8. (b) Làn M7.2 và M8.1: sản phẩm PCR dùng mồi 807/809 trên khuôn plasmit của khuẩn lạc có kí hiệu tương ứng sau khi tinh sạch; làn M: thang chuẩn 100bp
634bp
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
42
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy tôi đã thu được 6/74 khuẩn lạc mang đoạn chèn cải biến cho vector pSFV-M7 (kí hiệu M7.1 đến M7.6) và 4/65 khuẩn lạc mang đoạn chèn cải biến cho vector pSFV-M8 (kí hiệu M8.1 đến M8.4).
Trong Hình 18b, sản phẩm PCR sau khi tinh sạch của mẫu M7.2 và M8.1 cho các băng rõ nét nên được chọn để giải trình tự kiểm tra trình tự vùng cải biến. Kết quả giải trình tự các dịng M7.2 và M8.1 (hình 19 và 20) cho thấy các đoạn cải biến đã được chèn thành công vào đúng vị trí trên pSFV cơ bản như thiết kế.
Hình 19. Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M7
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
43
Hình 20. Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M8 3.3 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản 3.3 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản
3.3.1. Nhân dòng đoạn cADN mã hóa cho thu thể NK1 có đầu bằng bằng
phản ứng PCR dùng Pfu DNA polymerase
Chúng tơi nhân dịng thành công cADN mã cho thụ thể NK1 từ khn là vector nhân dịng pJET1.2-NK1 theo điều kiện phản ứng PCR được nêu ở bảng 15.
Hình 21. Ảnh điện di sản phẩm PCR cADN mã gen NK1 dùng Pfu DNA
polymerase. Làn 1: sản phẩm PCR, làn 2: thang chuẩn 1kb (Fermentas) Hình 21 cho thấy, kích thước sản phẩm điện di thu được phù hợp với kích thước lý thuyết (~1.3kb). Băng điện di thu được đặc hiệu, rõ, sáng cho thấy phân
1.3kb
Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học
44
đoạn cADN NK1 được nhân dòng đảm bảo chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Sản phẩn PCR được tinh sạch bằng AccuPrep PCR Purification Kit (K- 3034-1 của Bioneer). Kết quả đo quang phổ cho thấy chỉ số OD260/280=2.1, hàm lượng ADN thu được sau khi tinh sạch là 92,49ng/µl. Như vậy, đoạn gen mã cho NK1 có nồng độ và độ tinh sạch đảm bảo để thực hiện cho các thí nghiệm kế tiếp.
Bảng 15. Quy trình cho phản ứng nhân dịng đoạn cADN mã cho thụ thể NK1
3.3.2 Mở vòng pSFV bằng SmaI
Đầu tiên, chúng tôi cắt pSFV bằng SmaI theo quy trình đã tối ưu trong Bảng 16 tạo ra vector dạng thẳng có 2 đầu bằng.